雙膦酸鹽治療骨質(zhì)疏松導致的Th17與Treg細胞因子分泌失調(diào)的效果

李　沁　陳登科

(遵義市第一人民醫(yī)院老年病科，貴州　遵義　563000)

免疫系統(tǒng)動態(tài)調(diào)節(jié)骨骼的平衡〔1〕。參與調(diào)控骨骼重構(gòu)的主要有成骨細胞和破骨細胞〔2〕。大量炎癥疾病，如類風濕疾病、炎癥性腸道疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松等負向地影響骨骼重構(gòu)，它們往往通過影響成骨作用來打破這種平衡〔3〕。由于破骨細胞對骨質(zhì)的過量吸收，往往會導致骨骼的破壞，這一個過程的形成被CD4T細胞間接或直接調(diào)控〔4，5〕。T細胞通過直接作用于破骨細胞的前體細胞，可以誘導破骨細胞的分化〔6〕。T細胞對于破骨細胞形成的影響，依賴于其所分泌的正向調(diào)控與負向調(diào)控因子之間的平衡作用。雙膦酸鹽為普遍認可的破骨細胞形成抑制劑，臨床上被廣泛用于治療多種系統(tǒng)性的骨骼代謝疾病〔7〕。本文探究骨質(zhì)疏松患者在雙膦酸鹽治療后CD4T細胞的變化。

1　材料與方法

1.1受試者樣本選取廣西省人民醫(yī)院就診的骨質(zhì)疏松患者。年齡38～75歲，自愿參加本研究，研究前均未接受其他治療。年齡相匹配健康正常人為對照組。均經(jīng)過受試者的書面同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2外周血單個核細胞提取取受試者(治療1年)25 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)梯度離心。

1.3細胞刺激與酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析將分離得到的細胞重懸在1 ml細胞培養(yǎng)基中，加入50 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和1 μg/ml離子霉素，37℃細胞培養(yǎng)箱中刺激5 h后收上清，用ELISA試劑盒測細胞因子含量。采用ELISA檢測骨質(zhì)疏松患者與對照組輔助性T細胞(Th)1與Th2細胞分泌情況，并分析CD4T另兩個亞群Th17與Treg細胞的變化。

1.4RT-PCR分析將細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行RT-PCR檢測。分析Th17與Treg特異的轉(zhuǎn)錄因子RORγt與FOXP3的表達情況。

1.5試劑細胞培養(yǎng)基〔RPMI，10%胎牛血清(FBS)，55 μmol/L 2-硫基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 μg/ml慶大霉素，鏈霉素青霉素〕ELISA試劑盒購自ebioscience公司，RT-PCR試劑盒購于TAKARA公司。

1.6統(tǒng)計學方法應用Graph Pad Prism5.0軟件進行非配對t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1雙膦酸鹽對Th1、Th2細胞因子分泌的影響骨質(zhì)疏松患者Th1細胞分泌的細胞因子干擾素(IFN)γ〔(2 038.7±7.1)pg/ml〕、白細胞介素(IL)-12表達水平〔(727.2±3.1)pg/ml〕與對照組〔(2 073.3±7.5)pg/ml、(711.7±3.2)pg/ml〕差異無統(tǒng)計學意義(P=0.23，0.15)。骨質(zhì)疏松患者Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-5〔(822.2±2.5)pg/ml、(2 919.5±6.3)pg/ml〕與對照組〔(838.7±2.9)pg/ml、(3 033.3±6.9)pg/ml〕差異無統(tǒng)計學意義(P=0.36，0.093)。

2.2雙膦酸鹽對Th17與Treg細胞因子分泌的影響骨質(zhì)疏松患者Th17細胞分泌的細胞因子IL-17A與IL-23表達水平〔(78.8±2.2)pg/ml、(77.2±1.8)pg/ml〕顯著低于對照組〔(123.5±3.1)pg/ml、(171.7±3.5)pg/ml；P=0.000 53，0.003 9〕。而Treg細胞分泌的細胞因子IL-10、TGF-β水平〔(3 722.6±7.9)pg/ml、(4 119.2±9.4)pg/ml〕顯著高于對照組〔(2 838.7±6.3)pg/ml、(3 233.7±8.5)pg/ml；P=0.003 6，0.002 3〕。

2.3雙膦酸鹽治療后Th17與Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子表達變化Th17細胞特異的轉(zhuǎn)錄因子RORγt在骨質(zhì)疏松患者中表達水平(0.013 4±0.001 5)顯著低于對照組(0.032 5±0.002 1，P=0.004 6)。而Treg細胞特異的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3在骨質(zhì)疏松患者中(0.055 2±0.002 1)顯著高于對照組(0.023 8±0.001 6，P=0.001 4)。

3　討　論

骨質(zhì)疏松是一種慢性、漸進性功能障礙疾病。由于骨質(zhì)吸收超過骨質(zhì)形成，致使骨量下降和微體系結(jié)構(gòu)惡化，導致了骨的強度下降和增加骨易碎性的結(jié)果〔8〕。炎癥性的T細胞亞群可以觸發(fā)破骨細胞的形成，而Treg細胞被認為是執(zhí)行一個不同的效應〔9〕。

許多細胞因子，包括IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6和IL-11，已經(jīng)被報道可以促進骨質(zhì)吸收〔10～14〕。雙膦酸鹽能顯著降低Th17細胞因子是一個非常重要的發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)生IL-17的Th17細胞是破骨細胞形成的重要激活子〔4〕。在體外研究也發(fā)現(xiàn)，Th17細胞可以促進破骨細胞的形成，也因此被認為是Th亞群中最與破骨形成相關(guān)的細胞〔9〕。本研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松患者在接受了雙膦酸鹽治療后，Th17細胞因子分泌下降，而同時Treg細胞因子分泌上升。

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