納米探針芯片技術(shù)用于微量乙肝病毒DNA的檢測(cè)

戴穎

瓦房店市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 （遼寧 瓦房店 116300）

乙肝病毒（HBV）是一種危害性較大且具有傳染性的一類病毒。它進(jìn)入人體后會(huì)很快復(fù)制，病毒對(duì)肝臟損害嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致肝硬化腹水、肝癌，直接威脅患者生命[1]。HBV在傳染期有較大的活躍性，傳染性也很強(qiáng)，如果使用科學(xué)有效的檢測(cè)手段能在病毒復(fù)制的早期就將其找出并使用有效的醫(yī)療方法控制病毒，可以大大減少HBV在人群中的傳播，對(duì)于已經(jīng)感染了HBV的患者可以早期進(jìn)行對(duì)抗病毒的治療，防止病情惡化，改善患者的預(yù)后結(jié)局。在以往的臨床檢測(cè)中，常常用到PCR檢測(cè)，但納米探針技術(shù)有更高的檢測(cè)效率，靈敏度也很好[2]。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析納米探針技術(shù)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

納米金溶液，粒徑為（15±3.5）nm，基因芯片（上海百奧公司），0.2x檸檬酸鈉緩沖液SSC，含1g/L十二烷基硫酸鈉（SDS），銀染液和硝酸鈉（NaNO3）洗液均由本實(shí)驗(yàn)室自行制備[3]；Taq DNA連接酶和Taq連接酶緩沖液（美國(guó)Biolabs公司）；雜交液（瑞士羅氏公司）；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（18.3MΩ/cm）；實(shí)驗(yàn)所需探針序列均由大連TakaRa公司合成。

Prosys5510A型芯片點(diǎn)樣儀（美國(guó)Cartesian Technology公司）[4]；V-670型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Jasco公司）；DGG-9053A型恒溫干燥箱（韓國(guó)Sumsung公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM日本電子公司）；BX51型顯微鏡（日本Olympus公司）[5]。

1.2 方法

選擇待檢測(cè)的乙肝病毒DNA備用。應(yīng)用探針標(biāo)記技術(shù)、跟蹤技術(shù)達(dá)到定量檢測(cè)病毒中的DNA數(shù)量的目的。納米金探針1號(hào)是信號(hào)探針，和病毒DNA一端連接，納米金探針2號(hào)是檢測(cè)探針，和1號(hào)探針連接。另外選用磁珠探針1號(hào)作為捕捉探針，在檢測(cè)病毒DNA含量時(shí)，納米金探針和磁珠探針將DNA的靶序列夾在中間，形成一個(gè)三明治樣的整體結(jié)構(gòu)[6]。然后再利用磁場(chǎng)作用將三明治結(jié)構(gòu)分離，并從原溶液中分離，然后浸入DDT溶液，再將信號(hào)探針從納米金顆粒上洗脫。洗脫出的信號(hào)探針的數(shù)量直接反應(yīng)了DNA靶基因的多寡，將檢測(cè)探針和捕捉探針2號(hào)分別連接在信號(hào)探針的兩端，然后浸入銀染液，檢測(cè)探針顯色，得到靶目標(biāo)的DNA相對(duì)定量信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0對(duì)所得資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩組比較P＜0.05表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

經(jīng)過(guò)標(biāo)記后的納米金顆粒視野下更加清晰，顆粒直徑變大，且大小基本相同，顆粒的穩(wěn)定性與分散性更好。游離的堿基外露的DNA納米探針金溶液在波長(zhǎng)為520nm處有最高吸收峰，而與巰基非特異結(jié)合后在波長(zhǎng)525nm處有最高吸收峰。

納米金探針1號(hào)溶液按不同倍數(shù)稀釋成不同的濃度梯度后，檢測(cè)得出稀釋1倍的探針濃度（6.6nmol/L）信號(hào)幾乎無(wú)變化，故將其定為用量；同樣方法得出探針2號(hào)的稀釋倍數(shù)2倍信號(hào)變化不大，濃度為4.6nmol/L，將其定為濃度用量。檢測(cè)HBV DNA濃度低至8fmol/L時(shí)，雜交實(shí)驗(yàn)不顯色，或色弱，檢測(cè)的最低濃度值為8fmol/L。

3.討論

單鏈的DNA在納米金表面吸附性更強(qiáng)，非特異性吸附競(jìng)爭(zhēng)激烈，更容易結(jié)合，巰基與堿基迅速結(jié)合，探針金顆粒直徑變大，雜交率提高，影響了溶液的吸收波，色譜圖峰值偏移。信號(hào)探針雜交實(shí)驗(yàn)可以準(zhǔn)確定量到不同濃度梯度，不會(huì)造成檢測(cè)溶液的浪費(fèi)，同時(shí)精準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)濃度到達(dá)一定閾值后，會(huì)有明顯的減弱效果，所以可以測(cè)出這種方法最低檢測(cè)濃度值，增加了結(jié)果的可靠性和充分性，為臨床診斷提供更為科學(xué)的數(shù)據(jù)支持[7]。雜交實(shí)驗(yàn)相較于其他納米金探針染色更為直接、簡(jiǎn)單易行，而納米金探針技術(shù)的雜交不但汲取了傳統(tǒng)雜交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)信號(hào)強(qiáng)度的放大和精準(zhǔn)定位，提高了傳統(tǒng)方法檢測(cè)的效率和靈敏度，銀染效果更強(qiáng)，檢測(cè)最低濃度也更低，且節(jié)約儀器試劑設(shè)備費(fèi)用，經(jīng)濟(jì)效用更強(qiáng)[8]。染色信號(hào)捕捉精準(zhǔn)，特異性良好，該實(shí)驗(yàn)具有一定的獨(dú)立重復(fù)性，誤差較小。

[1]汪毅,毛紅菊,臧國(guó)慶,等.納米探針芯片技術(shù)用于微量乙肝病毒DNA的檢測(cè)[J].分析化學(xué),2014,38(8):1133-1138.

[2]毛紅菊,金慶輝,趙建龍,等.用于微量核酸檢測(cè)的納米探針芯片的研制及在乙肝病毒耐藥基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用[C].2008年全國(guó)納米生物和醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集,2015:96-98.

[3]邢亞斯,鄒能利,毛紅菊,等.基于雙納米金探針雜交法檢測(cè)HBV DNA[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2012,33(7):1420-1425.

[4]李瑋,龐代文,王業(yè)富,等.目視化乙肝病毒基因芯片[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2013,24(12):2186-2188.

[5]S Wang,L Li,H Jin,et al.Electrochemical detection of hepatitis B and papilloma virus DNAs using SWCNT array coated with gold nanoparticles[J].Biosensors & Bioelectronics,2013,41(1):205-210.

[6]BH Cha,SM Lee,JC Park,et al.Detection of Hepatitis B Virus (HBV) DNA at femtomolar concentrations using a silica nanoparticle-enhanced microcantilever sensor[J].Biosensors & Bioelectronics,2009,25(1):130-135.

[7]忻亮.基于金納米微粒的化學(xué)發(fā)光特定序列DNA分析[D].復(fù)旦大學(xué),2015.

[8]習(xí)東,寧琴,盧強(qiáng)華,等.Au納米顆粒HBV DNA基因探針的制備及其在目視化檢測(cè)HBV DNA中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào),2016,25(1):30-34,40.