生物解離大豆乳狀液中蛋白質結構特征分析

王立敏，陳 思，丁 儉，齊寶坤，王中江，江連洲，隋曉楠，Olga Olegovna BABICH，李 楊*

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物解離作為一種新興的經濟、安全、綠色提油技術，以機械破碎和酶解為手段，提取條件溫和，且提取的油脂品質較高、色澤較好[1]。但是，提油過程中由于雙親性磷脂、蛋白質對油脂的親和力，導致大部分油脂被包裹在乳狀液中，限制了油脂提取率，很大程度降低了該技術的經濟效益[2]。因此，探究乳狀液的穩(wěn)定特性，從而選擇合適的破除技術是提高油脂提取率的重要途徑之一。其中具有特殊功能性質的蛋白質是乳狀液失穩(wěn)的關鍵因素[3]。

近年來，較多關于酶解對乳液中蛋白質結構性能的研究。這些研究通常利用不同水解度（degree of hydrolysis，DH）的蛋白質制備乳液，分析酶解后蛋白質的結構特征變化。Avramenko等[4]研究表明酶解可以改變蛋白質的疏水位點，從而使表面疏水性及乳化特性發(fā)生變化；Zheng Lin等[5]研究表明酶解過程也可以改變蛋白亞基、構象及疏水性氨基酸組成，從而改變乳液的穩(wěn)定性。也有利用相反的方法來研究酶解對乳液中蛋白結構影響，即利用不同DH的天然乳液，從乳液中分離具有不同DH的肽，并分析不同酶解程度的蛋白質結構變化，Zhang Shaobing等[6]比較了水酶法花生乳狀液中蛋白與未酶解的花生蛋白表面特性（表面疏水性、二硫鍵、乳化特性、表面張力），發(fā)現(xiàn)經過酶解后乳狀液中蛋白質的二硫鍵、表面疏水性、乳化特性均下降，且發(fā)現(xiàn)由酶解引起的蛋白質分子質量、二硫鍵含量及表面疏水性的急劇下降有助于乳液的失穩(wěn)。但是目前缺乏關于生物解離大豆乳狀液蛋白質的研究，且具有特殊功能性質的蛋白質是穩(wěn)定乳狀液的關鍵因素，分析乳狀液蛋白質結構及表面特性是實現(xiàn)乳狀液失穩(wěn)的有效途徑。

Morales等[7]研究指出隨著酶解程度加深，生物解離大豆乳狀液越來越不穩(wěn)定。因此為了探究蛋白質/多肽穩(wěn)定乳狀液機制，采用酶解時間（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）作為研究條件，通過掃描電子顯微鏡觀察、乳化特性、表面疏水性、氨基酸分析及傅里葉變換紅外光譜對不同酶解程度下的乳狀液蛋白質/多肽表面性質及結構進行分析，以期為大豆生物解離過程中避免或減少乳狀液形成、尋求適當?shù)钠迫榉椒ㄌ峁┮罁?jù)與應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擠壓膨化大豆粉（擠壓膨化后的豆粕經研磨過60 目篩；成分：蛋白質質量分數(shù)40%，脂肪質量分數(shù)17%，纖維素質量分數(shù)7%） 山東高唐藍山股份有限公司；堿性蛋白酶Protex 6L（8 900 U/mL） 諾維信生物技術有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、丙酮等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌器 廣州儀科實驗儀器有限公司；水浴鍋英國IKA公司；PHS-25數(shù)顯臺式酸度計 上海雷磁儀器廠；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；L-8900全自動氨基酸分析儀Allegra64R臺式高速冷凍離心機、S-3400掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高麗公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離大豆乳狀液蛋白質的制備

根據(jù)江連洲等[8]的方法制備生物解離大豆乳狀液，首先稱取一定量的擠壓膨化大豆粉，按照質量比1∶6加入蒸餾水，再加入精準量取的Protex 6L堿性蛋白酶添加量1%、2%，用玻璃棒快速攪拌均勻并放入55 ℃水浴鍋中進行恒溫酶解，用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)勻漿pH值為9.0，分別酶解1、2、3 h后，再利用2 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至7，然后100 ℃加熱5 min進行滅酶處理。滅酶后于4 ℃、9 000×g離心20 min，離心后吸取游離油，倒出水解液后得到乳狀液。乳狀液水相中蛋白質提取方法采用丙酮沉淀法[9]，將冰丙酮與乳狀液按照體積比20∶1于-18 ℃反應2 h，然后于4 ℃、12 000×g離心15 min，除去上清液后的沉淀利用冰丙酮洗滌5～6 次，直到溶劑由黃色變成無色，最后蛋白質經凍干成粉末。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察

將凍干后的乳狀液蛋白樣品固定在樣品臺上鍍金，鍍金方法：離子濺射；鍍金條件：15 kV、15 mA、2.5 min。最后將樣品置于掃描電子顯微鏡（15 kV）下觀察其顯微結構。

1.3.3 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照Zhang Shaobing等[6]的方法測定乳狀液蛋白質的乳化活性指數(shù)（emulsion activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）：取30 mL不同酶解條件下乳狀液蛋白質溶液，分別加入10 mL大豆油均質使其混合均勻，取50 μL上述乳液加入5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液，渦旋振蕩混勻后在500 nm波長處測定吸光度A0。靜置30 min后再次測定吸光度A30。EAI和ESI按公式（1）、（2）計算：

式中：N為稀釋倍數(shù)（250）；C為乳液在形成前蛋白質水溶液中蛋白質的質量濃度/（g/mL）；Φ為乳狀液中油相體積分數(shù)/%；A0、A30分別為0、30 min時的吸光度。

1.3.4 表面疏水性的測定

依據(jù)Kato等[11]的方法，即ANS熒光探針法。稱取0.025 g不同酶解條件下的蛋白質樣品溶于50 mL 0.01 mol/L pH值為7的磷酸鹽緩沖液中，25 ℃攪拌1 h，然后以10 000×g離心30 min，利用Lowry法測定上清液蛋白質濃度，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液依次將樣品稀釋，得到濃度為0.005～0.5 mol/mL蛋白質溶液，取溶液4 mL，分別加入40 μL 8 mmol/L的ANS溶液，快速振蕩靜置5 min后，測定樣品的熒光強度。測定條件：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長468 nm，夾縫5 nm，掃描速率10 nm/s。以熒光強度和蛋白質濃度作圖，表面疏水性指數(shù)（S0）為蛋白質分子的初始段斜率。

1.3.5 氨基酸組成測定

利用氨基酸全自動分析儀酸水解法分別測定不同樣品氨基酸組成，取一定的樣品加入6 mol/L鹽酸溶液封管，然后在110 ℃烘箱中水解22 h，水解后用0.45 μm濾膜進行過濾，將濾液倒入50 mL容量瓶中，并用水定容。取1 mL濃縮，復溶，重復2～3 次后過濾進樣，進樣量50 μL。測定乳狀液蛋白質中17 種氨基酸含量[12]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜的測定

紅外光譜測定采用KBr壓片法，稱取真空凍干蛋白樣品1 mg，加入溴化鉀100 mg，然后在瑪瑙研缽中研磨約15 min，隨后進行壓片處理，壓片機在14 kg壓力下約保持1 min壓片后進行測定。在室溫條件下，設定掃描波數(shù)譜段范圍4 000～400 cm-1，分辨率設定為4 cm-1，在波數(shù)精度0.01 cm-1條件下掃描64 次，不同處理的圖譜掃描重復3 次。利用Peakfit Version軟件分析譜圖，采用Gauss峰形進行擬合后估算出子峰的位置和個數(shù)，根據(jù)各子峰與二級結構對應關系，利用積分面積計算各二級結構的相對含量[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗均重復3 次，利用ANOVA進行差異顯著性分析，并用Origin 8.0和Excel統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并繪圖，P小于0.05為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同酶解條件下乳狀液蛋白質微觀形態(tài)

圖1 不同酶解條件下乳狀液蛋白的掃描電子顯微鏡（×3 000）Fig. 1 Scanning electron microscope images of protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions ( × 3 000)

掃描電子顯微鏡可以直觀地觀察到酶解后乳狀液蛋白質的結構變化（顆粒大小、形狀），分析油滴被蛋白包裹狀態(tài)，進而分析乳液的穩(wěn)定性[14]。前人研究了乳狀液結構，其球狀油滴由表面蛋白包裹而成[1]，且發(fā)現(xiàn)酶解剛開始油滴被蛋白包裹，油脂與蛋白兩相分明，且大小分布均勻；隨著酶解進行，覆蓋在油滴表面的蛋白進入游離油相中，油滴發(fā)生聚集。據(jù)前期研究可知[15]，隨著酶解程度加深，DH逐漸增大。由圖1可知，在相同條件下觀察不同酶解程度的乳狀液蛋白質，發(fā)現(xiàn)其結構發(fā)生了明顯變化。酶解1 h時，乳狀液蛋白表現(xiàn)為致密有序的網狀結構，根據(jù)乳狀液結構分析，油脂可以較好地填充在蛋白質的網絡空間內，使乳狀液結構更加穩(wěn)定、均一，這與前期的研究[15]一致。隨著酶解程度的增加，乳狀液表面蛋白從油滴表面脫落，其結構由致密網狀結構變成了無規(guī)則的絮狀如圖1C、D所示，從而導致油滴發(fā)生聚集，乳狀液逐漸不穩(wěn)定[2]。酶解3 h時乳狀液蛋白質的電子顯微鏡圖更是發(fā)生了明顯變化，結構和質地變得疏松，緊密性逐漸減弱，并出現(xiàn)微小孔洞如圖1E、F所示。這主要由于剛開始DH比較低，部分蛋白質尚未水解掉，如圖1A、B中尚殘留有部分片狀蛋白質；隨著酶解程度的增加，乳狀液中的蛋白分子骨架被打開，酶分子進入蛋白分子內部，加深了蛋白質的酶解程度使其結構及質地變得疏松，緊密性越來越弱[16]，導致蛋白質越發(fā)失去了穩(wěn)定乳狀液的作用。

2.2 不同酶解條件對乳狀液蛋白質EAI和ESI的影響

圖2 不同酶解條件對乳狀液蛋白質EAI及ESI的影響Fig. 2 Effect of different hydrolysis conditions on emulsion activity index and stability index of protein emulsions

EAI表示的是乳狀液中蛋白質/肽能夠強烈吸附在油-水界面形成乳化層的能力；ESI代表乳狀液中乳滴的穩(wěn)定能力。EAI和ESI為乳狀液中蛋白質/肽乳化特性及穩(wěn)定性的重要指標之一[17]。Zhao Qiang[18]及Lam[19]等研究發(fā)現(xiàn)酶解不利于蛋白質的乳化特性，蛋白質的乳化特性和肽的尺寸之間存在明確聯(lián)系，即酶解產生的小分子質量肽會使蛋白質溶解性增加，降低蛋白質的乳化特性；同時，小分子質量肽會降低界面張力不足以穩(wěn)定乳液，也會削弱其乳化特性。經由不同酶解時間（1、2、3 h）及不同酶添加量（1%、2%）后，從圖2可以看出，隨著酶解的進行，EAI和ESI總體也都呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，且變化較明顯，由酶解條件1%、1 h（EAI為200 m2/g，ESI為80 min）變化到2%、3 h（EAI 為110 m2/g，ESI為30 min），這主要由于隨著酶解過程的進行，吸附在油滴表面的蛋白被酶解成小分子質量的肽，導致其從油滴表面脫落，再重新與油滴吸附時，不能迅速吸附在油滴表面，界面膜遭受破壞，無法保持完整性，其EAI和ESI大幅度降低[20]。另外，蛋白酶的過度酶解也會使維持界面蛋白的內部結構力（包括氫鍵、范德華力、離子鍵等）逐漸被破壞，使包裹油滴的保護膜越來越薄，導致EAI和ESI的降低[21]，這也是乳狀液失穩(wěn)的重要原因之一。

2.3 表面疏水性結果

圖3 不同酶解條件對乳狀液蛋白質表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of different hydrolysis conditions on surface hydrophobicity of protein emulsions

S0是用來表征蛋白表面疏水基團數(shù)量的一個重要指數(shù)，也是反映蛋白質分子結構變化的重要指標之一[22]。Zhang Shaobing[6]與Betancur[23]等發(fā)現(xiàn)蛋白質發(fā)生酶解時會暴露出大量的疏水性殘基，同時在酶解反應過程中，暴露出的疏水性殘基會發(fā)生交聯(lián)聚集，導致蛋白質疏水性下降。圖3為不同酶解條件下的乳狀液蛋白質表面疏水性，酶添加量1%、酶解時間1 h時，S0最大（260），隨著酶解時間延長及酶添加量的增加，S0逐漸減小，酶添加量2%、酶解時間3 h時，S0達到最小值（90），這與Betancur等[23]結果一致。推測是由于酶解過程中，蛋白質發(fā)生變性而暴露出內部的疏水殘基，亞基之間通過疏水相互作用而發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，這些聚集體會對蛋白質的疏水區(qū)域產生屏蔽作用，阻礙了疏水基團與熒光探針ANS的有效結合，導致乳狀液蛋白質表面疏水性降低[24]，蛋白疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，從而使乳狀液失穩(wěn)。

2.4 乳狀液中蛋白質的氨基酸組成分析

表 1 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質/多肽的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of protein emulsions obtained under different enzymatic hydrolysis conditions

表面疏水性和疏水性氨基酸是2 個相關性指標。從表1可以看出，隨著酶解程度的進行，乳狀液蛋白質中Ile、Try、Phe、Leu、Val、Ala等比例增加，其中Ile、Leu、Phe、Val均為疏水氨基酸，這與Zheng Lin等[5]的研究一致。這是由于在酶解過程中，蛋白質的構象發(fā)生變化，使一些脂肪族和芳香族氨基酸側鏈基團從蛋白質分子的內部結構暴露出來，酶解程度越深，這些芳香族氨基酸暴露的越多，而一些帶有苯環(huán)的芳香族氨基酸大多是疏水性氨基酸（如Phe、Try、Trp），因此酶解導致疏水性氨基酸比例增加[25]。另外，F(xiàn)ischer等[26]研究表明酶解后由高比例的疏水性氨基酸引起的疏水性相互作用對肽聚集有很大貢獻，酶解使蛋白質的肽鏈越來越短，其受到的空間阻礙越來越弱，這時肽鏈更容易通過疏水相互作用發(fā)生聚集，從而減少了與熒光探針相結合的疏水基團數(shù)量，S0呈下降趨勢，且酶解程度越深，其疏水性指數(shù)降低的越明顯，表面疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，導致乳狀液失穩(wěn)，這與上述S0結論一致。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜圖可提供蛋白質酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶信息以及蛋白質結構中的C—C振動和C=O等振動信息[27]。另外，傅里葉變換紅外光譜中蛋白質酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）頻率的遷移與蛋白質二級結構緊密相關。根據(jù)已有研究，蛋白質二級結構與各子峰間的對應關系為：α-螺旋結構對應波數(shù)為1 646～1 664 cm-1；β-折疊結構對應波數(shù)為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；β-轉角結構對應波數(shù)為1 664～1 681 cm-1；無規(guī)則卷曲結構對應波數(shù)為1 637～1 645 cm-1[28]。采用Peakfit軟件對蛋白質紅外光譜酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）進行二階導數(shù)紅外去卷積光譜擬合，通過峰位歸屬確定二級結構種類和相對含量，計算結果見表2。

圖4 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質紅外光譜分析Fig. 4 FTIR spectra of protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions

圖5 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質酰胺I帶的擬合圖譜Fig. 5 Second-derivative FTIR spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting for protein emulsions prepared under different enzymatic hydrolysis conditions

表2 不同酶解條件下乳狀液中蛋白質的二級結構相對含量Table 2 Contents of the secondary structures of protein emulsions obtained under different enzymatic hydrolysis conditions%

由圖4可以看出，隨著酶解程度的加深，峰的強度及峰面積發(fā)生了變化。3 200～3 700 cm-1之間的吸收峰變強、面積增大，這主要由于酶解過程中肽鍵斷裂引入H2O分子，導致—OH的伸縮振動和—NH的振動[29]。另外，由圖5得出，酶解過程中只是峰的強度及峰面積發(fā)生了改變，乳狀液蛋白質分子上的化學基團沒有發(fā)生本質的變化，說明酶解改變了乳狀液蛋白質構象所占的比例，導致二級結構發(fā)生不同程度的變化（表2）。隨著酶解程度的加深，α-螺旋及β-折疊結構均呈現(xiàn)降低趨勢，且轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結構，在蛋白質二級結構中，無規(guī)則卷曲與其他幾種構象相比顯然是一種更加松散的結構，無規(guī)則卷曲增加，說明蛋白質穩(wěn)定乳液的能力降低。推測是由于酶解過程使得維持界面蛋白的內部結構力（包括氫鍵、范德華力、離子鍵等）逐漸被破壞，改變了乳狀液蛋白質的空間構象，乳狀液逐漸失去穩(wěn)定性[30]。

3 結 論

本實驗選用不同酶解時間（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）條件下得到的生物解離大豆乳狀液蛋白質，分析了不同酶解條件對乳狀液蛋白質/多肽表面性質及結構特征的影響。

通過掃描電子顯微鏡結果顯示：酶解剛開始由于DH較低，乳狀液蛋白表現(xiàn)為致密有序的網狀結構，酶解時間3 h時乳狀液蛋白發(fā)生了明顯變化，結構和質地開始疏松，并伴隨微小孔洞出現(xiàn)。根據(jù)乳狀液的結構分析，剛開始酶解時，油脂可以較好地填充在蛋白質的網絡空間內，使乳狀液結構更加穩(wěn)定、均一；酶解時間3 h時的蛋白質越發(fā)失去了穩(wěn)定乳狀液的作用。

EAI和ESI分析表明，隨著酶解的進行，EAI和ESI皆呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。主要由于隨著酶解過程進行，吸附在油滴表面的蛋白被酶解成小分子質量的肽，導致其從油滴表面脫落，再重新與油滴吸附時，不能迅速吸附在油滴表面，這也是乳狀液失穩(wěn)的重要原因之一。

氨基酸組成及表面疏水性分析發(fā)現(xiàn)，隨著酶解的進行，表面疏水性下降。由于酶解后的疏水性殘基之間通過疏水相互作用發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，對蛋白質的疏水區(qū)域產生屏蔽作用，導致表面疏水性下降；同時高比例疏水氨基酸引起的肽聚集，減少了與熒光探針相結合的疏水基團數(shù)量，導致表面疏水性降低。表面疏水性降低使其不容易吸附于油滴表面，使乳狀液失穩(wěn)。

通過擬合紅外光譜酰胺I帶發(fā)現(xiàn)，隨著酶解程度的增加，α-螺旋、β-折疊結構呈現(xiàn)降低趨勢，趨于更加松散的無規(guī)則卷曲結構增加，導致蛋白質穩(wěn)定乳液的能力降低。

生物解離乳狀液為半固體狀，屬于食品膠體，因此通過上述指標研究乳狀液中蛋白質/肽穩(wěn)定乳狀液機制，發(fā)現(xiàn)酶解過程中乳狀液蛋白EAI和ESI降低，部分蛋白質疏水性氨基酸殘基比例增大，蛋白質二級結構α-螺旋、β-折疊結構轉化為無規(guī)則卷曲。這是酶解過程中乳狀液失穩(wěn)主要原因之一。該結論為生物解離乳狀液破乳機制提供理論支持。