結(jié)直腸癌患者血漿中可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白的水平及其臨床意義

白駒 楊力芳

隨著人口老齡化的加重和生活方式的變化，中國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)生率和死亡率逐年攀升，到2015年止，結(jié)直腸癌在中國(guó)城市癌癥發(fā)病率中位居第三位，死亡率位居第四位［1?2］，嚴(yán)重影響人類的生命健康。如何有效評(píng)估患者病情并明確其發(fā)生發(fā)展機(jī)制是臨床及基礎(chǔ)工作中面臨的首要問(wèn)題?？扇苄匝ㄕ{(diào)節(jié)蛋白（soluble thrombomodulin，sTM）是一種存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖蛋白，在血管內(nèi)皮受損傷后可快速釋放入血，可作為檢測(cè)血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物［3］。近年來(lái)許多研究顯示，sTM與急性淋巴細(xì)胞白血病、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤存在密切關(guān)系［4?5］，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血漿中sTM水平及其在不同發(fā)展階段的變化，探討其在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

觀察對(duì)象為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2014年1月至2016年9月普外科收治的60例結(jié)直腸癌患者，年齡在37～69歲，平均51歲，其他基本情況見(jiàn)表1。表1中的高惡性指病理檢查結(jié)果為低分化的腺癌，TNM分期根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer，UICC）和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）合作制定的第 7版腫瘤TNM分期［6］。體檢中心60例正常成人，其中男性35人，女性25人，年齡在37～70歲，平均年齡54歲；活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者20例，男性12例，女性8例，年齡在31～64歲，平均46歲。3組患者男女比例及年齡無(wú)顯著差異（P＞0.05），具有可比性。所有結(jié)直腸癌患者均為首次發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，入院前未經(jīng)過(guò)任何抗癌治療，且不合并其他影響凝血功能的疾病，以及其他器質(zhì)性疾病。

1.2 檢測(cè)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immuno?sorbent assay，ELISA）檢測(cè)3組觀察對(duì)象血漿中sTM水平，所用試劑盒由法國(guó)Dignosticastago公司提供，取患者入院后2 h以內(nèi)及治療后1～2周的靜脈血2 mL，體檢中心單次采血2 mL，分裝1 mL于抗凝管中，輕搖后，4℃3000r/min離心10 min，-80℃保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)按試劑盒說(shuō)明書操作。

表1 結(jié)直腸癌患者臨床病理資料Table 1 Clinical pathological data of colorectal cancer patients

1.3 治療方法

術(shù)前 PET?CT（positron emission tomography?CT）評(píng)估TNM分期，采用以手術(shù)為主的綜合治療原則，根據(jù)患者全身狀況和各個(gè)器官的功能狀態(tài)、腫瘤的位置、分期、病理類型等決定綜合治療措施。所有患者均行手術(shù)治療，手術(shù)方法：患者于術(shù)前行纖維結(jié)腸鏡檢查，觀察原發(fā)灶情況，在距腫瘤緣10 cm結(jié)扎腫瘤兩側(cè)腸管，腔內(nèi)注入30 mg/kg的5?氟尿嘧啶，離斷腸系膜血管行根部淋巴結(jié)清掃術(shù)，腸道重建并縫合切口，放置引流管，關(guān)閉腹腔。其中39例Ⅲ期及Ⅳ期患者采用5?氟尿嘧啶（375 mg/m2）聯(lián)合亞葉酸鈣（20 mg/m2）的輔助化療方案，療程總時(shí)長(zhǎng)6個(gè)月?；颊呙?個(gè)月定期復(fù)查血漿sTM水平，中途丟失的病例以最近一次檢測(cè)結(jié)果代替。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差分析比較檢查結(jié)果，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較采用SNK法，sTM與TNM分期之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組患者sTM的變化趨勢(shì)

比較結(jié)直腸癌患者治療過(guò)程中sTM水平的變化情況，結(jié)果顯示，術(shù)后2月及以后，單純手術(shù)組患者及手術(shù)聯(lián)合化療治療的患者的sTM水平均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），手術(shù)聯(lián)合化療組在術(shù)后第2月時(shí)的sTM水平顯著低于單純手術(shù)組的sTM水平（P＜0.05），在術(shù)后第4月及第6月時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 腫瘤組患者在治療過(guò)程中sTM水平的變化情況（±s，ng/mL）Table 2 The change of sTM level in the tumor group during treatment（±s，ng/mL）

表2 腫瘤組患者在治療過(guò)程中sTM水平的變化情況（±s，ng/mL）Table 2 The change of sTM level in the tumor group during treatment（±s，ng/mL）

相比術(shù)前*P＜0.05，**P＜0.01，相比單純手術(shù)▲P＜0.05。

組別單純手術(shù)組手術(shù)聯(lián)合化療組n 21 39術(shù)前69.7±13.9 73.8±12.3術(shù)后1天70.7±11.6 72.8±15.8術(shù)后2月59.1±10.4*54.5± 12.6*▲術(shù)后4月50.6±8.3**53.9±7.1**術(shù)后6月43.9±7.5**48.4±8.7**

2.2 治療前腫瘤組、潰瘍組及正常組sTM水平比較

比較結(jié)直腸癌患者治療前與潰瘍組及正常組sTM水平之間的差異，結(jié)果顯示，腫瘤組血漿中sTM 水平為（70.4±14.5）ng/mL，顯著高于潰瘍組（36.9±8.6）ng/mL及正常組（31.7±7.3）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總F值為17.14，兩兩比較結(jié)果分別為P＜0.05，P＜0.01）。潰瘍組sTM水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組血漿sTM表達(dá)水平比較Figure 1 Comparison of plasma sTM expression between each groups

2.3 腫瘤組TNM分期與sTM水平的關(guān)系

從表3結(jié)果可以看出，隨著患者TNM分期的升高，sTM水平逐漸上升，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者與正常組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅰ期患者與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Spearman相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者TNM分期與sTM水平呈正相關(guān)（rs=0.675，P＜0.05）。

表3 正常組及腫瘤組不同TNM分期的患者sTM水平Table 3 The sTM levels of the patients in the normal groupand tumor group with different TNM stages

2.4 治療前后結(jié)直腸癌患者sTM水平的變化

隨訪6個(gè)月后檢測(cè)患者血漿中sTM水平，結(jié)果顯示，行單純手術(shù)治療的患者治療后sTM水平（43.9±7.5）ng/mL，手術(shù)聯(lián)合輔助化療的患者治療后sTM水平（48.4±8.7）ng/mL，顯著低于治療前（70.4±14.5）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總F值為9.38，兩兩比較結(jié)果均為P＜0.05）。單純手術(shù)患者與手術(shù)聯(lián)合輔助化療患者sTM水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 治療前后結(jié)直腸癌患者血漿sTM表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of plasma sTM levels in patients before and after treatment

sTM是存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，生理情況下僅有少量由內(nèi)皮細(xì)胞膜表面水解游離于血漿中。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞大量受損時(shí)，其在血漿中的含量就會(huì)明顯升高，因此sTM可作為反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物之一。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其發(fā)生過(guò)程主要經(jīng)過(guò)局部浸潤(rùn)，侵入血管內(nèi)皮進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，隨血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移并在血管中存活、移出，在轉(zhuǎn)移部位定植。腫瘤細(xì)胞由原發(fā)部位浸潤(rùn)侵入循環(huán)系統(tǒng)后，作為游離的微轉(zhuǎn)移灶是十分脆弱的，它們的轉(zhuǎn)移潛力很大程度上取決于逃避免疫系統(tǒng)的能力和穿透血管內(nèi)皮屏障的能力，然而目前其穿透血管內(nèi)皮屏障的機(jī)制尚不完全明確。有許多研究報(bào)道，惡性腫瘤可通過(guò)多種途徑損傷內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，以促進(jìn)游離的腫瘤細(xì)胞定植，如研究顯示，體內(nèi)和體外的腫瘤細(xì)胞均能通過(guò)上調(diào)NF?κB和JNK通路及caspase?8?FLIPL 通路等［7?11］，促進(jìn)淀粉樣前體蛋白和其死亡受體?6（death receptor 6，DR?6）的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞壞死［12］，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的外滲和轉(zhuǎn)移。Thuringer等［13］的研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞可通過(guò)影響毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，使得內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生障礙，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移。sTM水平的上調(diào)可能是由于惡性腫瘤致內(nèi)皮細(xì)胞損傷使血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）釋放入血所致。Hagag等［4］也在其研究中發(fā)現(xiàn)在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒中持續(xù)高水平的sTM預(yù)示著不良預(yù)后。同時(shí)，Liu等［5］在其體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)干擾非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的TM的表達(dá)可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；Wu等［14］在研究中發(fā)現(xiàn)抑制膀胱癌細(xì)胞TM的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）過(guò)程的發(fā)生，并可促進(jìn)血管生成；Zheng等［15］發(fā)現(xiàn)TM在非小細(xì)胞肺癌中可引起細(xì)胞G1期阻滯的發(fā)生和顯著降低細(xì)胞克隆形成的能力，同時(shí)可顯著升高鈣粘附蛋白E（E?cadherin）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附作用，逆轉(zhuǎn)EMT的過(guò)程。綜上，sTM可能作為一種血管保護(hù)因子或腫瘤抑制因子，在體內(nèi)發(fā)揮著拮抗腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

本研究顯示，結(jié)直腸癌患者血漿sTM水平顯著高于活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者及正常人群，姜齊宏等［16］也在結(jié)直腸癌患者血清中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的升高，推測(cè)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展可能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷。進(jìn)一步對(duì)結(jié)直腸癌患者各個(gè)TNM分期的人群與正常人群的血漿sTM水平比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期患者與正常人群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，可能由于血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)明顯損傷，sTM水平差異不顯著。然而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的損傷，sTM水平隨之升高。Spearman相關(guān)性分析的結(jié)果顯示TNM分期的級(jí)別與患者血漿sTM水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展與sTM的密切關(guān)系。手術(shù)或聯(lián)合化療治療后，患者sTM水平也隨之降低，推測(cè)是由于癌細(xì)胞進(jìn)展的控制，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕所致。單純手術(shù)患者治療后第2個(gè)月的sTM水平顯著高于手術(shù)聯(lián)合化療組，推測(cè)可能的原因是由于手術(shù)聯(lián)合化療藥物的短期療效優(yōu)于單純手術(shù)，但第6個(gè)月后單純手術(shù)患者sTM水平略低于手術(shù)聯(lián)合化療組，可能是因?yàn)槭中g(shù)聯(lián)合化療組患者本身來(lái)源于Ⅲ、Ⅳ期結(jié)直腸癌患者，病情較重，即使短期控制效果優(yōu)于單純手術(shù)組，但長(zhǎng)遠(yuǎn)療效低于單純手術(shù)組。鄭娜娜［17］在其研究中發(fā)現(xiàn)TM可抑制肺癌細(xì)胞的成瘤能力及遷移作用，是潛在的抑癌蛋白?；趕TM與結(jié)直腸癌病情嚴(yán)重程度的密切關(guān)系以及上述已有的研究，推測(cè)sTM可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞間的緊密連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，以及對(duì)腫瘤EMT過(guò)程的逆轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞分子分型的影響。

本研究對(duì)sTM在不同情況下結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)水平進(jìn)行了探究，但sTM在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用并不明確，筆者擬進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)其確切作用進(jìn)行探究，進(jìn)一步挖掘sTM在臨床和基礎(chǔ)工作中的潛在價(jià)值。綜上所述，sTM不僅能夠有效地反映結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展情況，也為明確結(jié)直腸癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了線索，是潛在的腫瘤診斷分子標(biāo)志物。

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