旋毛蟲plancitoxin-1-like基因的序列分析與編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

廖成水，王曉利，田文靜，楊亞東，張夢珂，王安琪，張春杰，劉明遠(yuǎn)，Boireau Pascal,5，程相朝,3*

(1. 河南科技大學(xué)，動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471023；2. 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，洛陽 471023；3. 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，洛陽 471003；4. 吉林大學(xué) 人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130062；5. 法國國家食品、環(huán)境及勞動(dòng)衛(wèi)生署動(dòng)物衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室, 邁松阿爾福 94706)

脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)具有DNase I(EC 3.1.21.1)和DNase II(EC 3.1.22.1)兩大類[1]。1988年首次報(bào)道人類DNase II基因后[2]，DNase II在脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物和單細(xì)胞原蟲中被陸續(xù)報(bào)道[3]。旋毛蟲是一種寄生于骨骼肌細(xì)胞的重要人獸共患胞內(nèi)寄生蟲，主要分布于中國、阿根廷和部分東歐國家等[4]。旋毛蟲基因組顯示旋毛蟲具有多達(dá)125個(gè)DNase II蛋白家族基因[5]。在這之前含有最多DNase II的物種是秀麗桿線蟲(僅10種)[6]，旋毛蟲如此龐大的蛋白家族在其他物種中實(shí)屬罕見，而關(guān)于旋毛蟲DNase II的研究仍未見有明顯進(jìn)展。經(jīng)典DNase II的氨基酸序列在N端和C端都具有高度保守區(qū)域，即HKD基序[7]。在線軟件分析顯示旋毛蟲125個(gè)基因中僅僅plancitoxin-1(1 095 bp, GenBank accession No. XM_003370715.1)含有一個(gè)HKD基序，且位于C端。因此，本研究克隆得到旋毛蟲plancitoxin-1基因，并分析其序列特征，以期為龐大的DNase II蛋白家族在旋毛蟲發(fā)育和感染中的作用研究提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Wistar大鼠(200.0 g±20.0 g)購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；中國河南豬旋毛蟲分離株Trichinellaspiralis(genotype T1)，國際標(biāo)準(zhǔn)蟲種編號為ISS534，由本實(shí)驗(yàn)室小鼠傳代保種；pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌DH5α購自德國Novagen公司，由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凍存；胰蛋白胨和酵母浸出物購自英國OXOID公司；胃蛋白酶購自中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；青霉素、硫酸鏈霉素均購自美國Sigma-Aldrich公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、BamHⅠ、HindⅢ和RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0均購自寶生物工程(大連)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 Plancitoxin-1基因的克隆

根據(jù)GenBank上的旋毛蟲plancitoxin-1基因序列(GenBank No.: XM_003370715.1)設(shè)計(jì)引物(上游引物：5′-GGATCCATGGACGCACGTCGGCCGGTAT-3′，BamHⅠ；下游引物：5′-AAGCTT TCAATATGGTGGAATAGGACAAAGT-3′，HindⅢ)。常規(guī)方法收集旋毛蟲肌幼蟲、新生幼蟲和成蟲蟲體，根據(jù)Trizol試劑盒的方法得到三個(gè)時(shí)期總RNA。根據(jù)RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒的方法得到cDNA。以旋毛蟲cDNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得plancitoxin-1基因。

1.3 同源性分析

利用CLASTALX 2.1進(jìn)行二十余種物種DNase II蛋白多重序列分析。采用PHYLIP 3.695-NEIGHBOR重復(fù)1 000次的bootstrap法進(jìn)行氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析。

1.4 理化性質(zhì)分析

在線網(wǎng)站ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小、理論等電點(diǎn)和氨基酸組成。在線網(wǎng)站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html和http://biotech.ou.edu/分別用于分析氨基酸的稀有密碼子和重組蛋白質(zhì)的可溶性。在線網(wǎng)站ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的親水性與疏水性。

1.5 結(jié)構(gòu)分析

在線網(wǎng)站http://www.cbs.dtu.dk/services/的NetNGlyc、NetOGlyc和NetPhos分別分析N-糖基化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。在線網(wǎng)站http://www.embl-heidelberg.de/ predictprotein/predictprotein.html分析二硫鍵數(shù)量。http://tools.immuneepitope.org/bcell/和NetCTL (http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測蛋白可能存在的線性B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。在線軟件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/ npsa_server.html預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。SWISS-MODEL Workspace分析三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 Plancitoxin-1-like基因的克隆

從旋毛蟲中擴(kuò)增得到一條885 bp的序列(圖1)，與plancitoxin-1(Tsp_09974, GenBank No. XM_003370715.1)相比，核苷酸序列少210 bp，缺少部分位于184—393位，將其命名為plancitoxin-1-like。從肌幼蟲、成蟲和新生幼蟲擴(kuò)增得到的plancitoxin-1-like序列均一致，而從基因組擴(kuò)增的序列與NCBI公布的1 471 bp一致。Plancitoxin-1-like編碼294個(gè)氨基酸，比plancitoxin-1少70個(gè)氨基酸，缺少部分位于62—131位。保守區(qū)域預(yù)測顯示plancitoxin-1只有一個(gè)HKD基序，且位于C端，但plancitoxin-1-like在N端和C端均具有HKD基序。

2.2 同源性分析

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (DL2000)；1. 水對照；2. 肌幼蟲；3. 新生幼蟲；4. 成蟲；5. 基因組M. DNA marker ladder (DL2000); 1. ddH2O control; 2. ML; 3. NBL; 4. Ad; 5. T. spiralis genome圖1 旋毛蟲plancitoxin-1-like基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of T. spiralis plancitoxin-1-like gene by PCR

Plancitoxin-1-like的核苷酸序列與其他物種的DNase II的相似性較低，最高的是廣桿屬線蟲CBR-CRN-6基因(10.07%)，與人類、牛、馬、豬、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、非洲蟾蜍、果蠅、海星、河豚、類鼻疽桿菌、盤基網(wǎng)柄菌、雞痘病毒、金絲雀痘病毒、岡比亞按蚊、廣桿屬線蟲和秀麗桿線蟲等DNase II成員的相似性集中在34%～38%，與海星plancitoxin-1具有40.18%的相似性，遺傳進(jìn)化關(guān)系上被分在一個(gè)進(jìn)化支(圖2)，但保守區(qū)域基本相同。Plancitoxin-1-like與低等生物具有較近的親緣關(guān)系，且更靠近于DNase IIβ。

2.3 Plancitoxin-1-like的理化性質(zhì)分析

Plancitoxin-1-like的理論相對分子質(zhì)量為33.19 ku，理論等電點(diǎn)為9.17。分子式為C1507H2333N399O425S1。不穩(wěn)定系數(shù)為39.25，屬于穩(wěn)定存在蛋白質(zhì)。氨基酸由20種氨基酸組成，不含Sec和Pyl，其中頻次較高的氨基酸殘基有Leu、Ser和Lys；頻次較低的氨基酸殘基有Met、Cys和His。正電荷殘基數(shù)(R+K)為33個(gè)，負(fù)電荷殘基數(shù)(D+E)為24個(gè)。含有26個(gè)稀有密碼子，其中有兩處連續(xù)出現(xiàn)稀有密碼子，在大腸桿菌中呈可溶性表達(dá)的可能性為8.8%。在287位親水性分值最高(1.967)，有最強(qiáng)的疏水性；在175位分值最低(-2.811)，有最強(qiáng)的親水性。

2.4 序列結(jié)構(gòu)分析

在N19GS、N49NT、N209CS和N262RS共有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。在L22、L26和A108共有3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。存在31個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為14個(gè)Ser、9個(gè)Thr和8個(gè)Tyr，潛力值均大于0.5。有17個(gè)B細(xì)胞線性結(jié)合位點(diǎn)和9個(gè)T細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由42個(gè)α-螺旋(14.29%)、83個(gè)延伸鏈(28.23%)和162個(gè)無規(guī)卷曲(55.10%)構(gòu)成。存在3個(gè)二硫鍵，分別位于59和101位、210和269位、250和289位(圖3)。Plancitoxin-1-like三維結(jié)構(gòu)同源模型見圖4，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)序列與PDB數(shù)據(jù)庫中5i3e.1.A模板序列相似性為31.79%。

圖2 Plancitoxin-1-like與其他物種DNase II家族蛋白的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of plancitoxin-1-like and other previously reported DNase II family proteins

圖3 Plancitoxin-1-like蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Predicted secondary structure of plancitoxin-1-like protein

3 討 論

圖4 Plancitoxin-1-like三維結(jié)構(gòu)同源模型Fig.4 Three-dimensinal model of plancitoxin-1-like

1999年，C. H. Mak等首次發(fā)現(xiàn)旋毛蟲排泄分泌產(chǎn)物具有降解DNA的活性[8]。來源于排泄分泌產(chǎn)物的43 ku蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物DNase II序列具有一定的同源性[9]，但由于缺乏DNase II保守的活性位點(diǎn)，該43 ku蛋白質(zhì)是否具有DNase II活性仍然存在爭議。2011年公布的旋毛蟲基因組顯示，旋毛蟲可能存在一個(gè)高達(dá)125種DNase II蛋白家族。人類、牛、馬、豬、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、非洲蟾蜍、果蠅、海星、河豚、類鼻疽桿菌、盤基網(wǎng)柄菌、雞痘病毒、金絲雀痘病毒、岡比亞按蚊、廣桿屬線蟲和秀麗隱桿線蟲等物種只有一種或幾種DNase II[10]，而秀麗隱桿線蟲具有最多DNase II。但旋毛蟲擁有如此多的DNase II家族成員有何作用仍不清楚。43 ku蛋白具有一個(gè)螺旋環(huán)螺旋基序分子結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化的功能[11]，因此與旋毛蟲包囊形成有關(guān)[12]。125種旋毛蟲DNase II蛋白50%以上的基因編碼排泄分泌產(chǎn)物，DNase II蛋白被認(rèn)為是控制和預(yù)防旋毛蟲病的理想疫苗候選蛋白質(zhì)。

DNase II在N端和C端包含有兩個(gè)保守的HKD基序(H-x-K-x(4)-D)[7]。旋毛蟲p43、SS1和AAK85403三個(gè)蛋白與人類DNase II具有一定的相似性，但缺乏DNase II經(jīng)典的HKD基序[13]。但除了plancitoxin-1具有一個(gè)DNase II保守活性位點(diǎn)，其他124種DNase II蛋白都不具有DNase II保守活性位點(diǎn)。在本研究中，plancitoxin-1-like具有兩個(gè)HKD基序，分別位于序列的N端和C端。由于小鼠、大鼠、河豚和斑馬魚DNase IIβ的C端保守區(qū)域?yàn)镈HSK，因此，根據(jù)DNase IIα和DNase IIβ在C端的HKD保守基序分別為DHSK和DHAK的說法很難把plancitoxin-1-like歸為DNase IIα還是DNase IIβ。但遺傳進(jìn)化樹分析顯示，plancitoxin-1-like的親緣關(guān)系更靠近于DNase IIβ(圖2)。

4 結(jié) 論

以旋毛蟲總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得旋毛蟲plancitoxin-1-like基因，得到的核苷酸序列為885 bp，編碼294個(gè)氨基酸，由20種氨基酸組成。其氨基酸序列在N端和C端都具有HKD基序。蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為33.19 ku，等電點(diǎn)為9.17，是穩(wěn)定存在的親水性蛋白。plancitoxin-1-like的氨基酸序列與其他物種DNase II的相似性為35%左右。

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