鐵蛋白Ferritin原核表達和純化及納米顆粒胞外自組裝

李志鵬，劉福航，崔奎青，石德順，劉慶友

(廣西大學(xué),亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護利用國家重點實驗室,南寧 530004)

鐵蛋白于1937 年由V.Laufberger[1]分離純化于馬的脾中，是生命活動所必需的蛋白之一。鐵蛋白是一個古老而龐大的蛋白家族，廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)[2]。鐵蛋白本身在生命活動中的功能已經(jīng)得到廣泛研究，如調(diào)節(jié)鐵元素的代謝平衡、抗氧化脅迫以及消除某些重金屬和有毒分子毒害等功能[3-6]。近年來，隨著納米技術(shù)的廣泛應(yīng)用和對鐵蛋白結(jié)構(gòu)的進一步認(rèn)識, 鐵蛋白納米載體正成為腫瘤造影和藥物呈遞等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點[7-8]。天然合成的鐵蛋白主要由一個礦物質(zhì)內(nèi)核和一個蛋白外殼組成。蛋白外殼是一個由24個鐵蛋白亞基組成的球形空心納米籠狀結(jié)構(gòu)，其中每3個亞基組成一個三聚體亞單位，8個三聚體亞單位再組裝成外徑12 nm，內(nèi)徑8 nm的蛋白外殼[9]。1991年，英國巴斯大學(xué)F. C. Meldrum[10-11]實驗室首次在馬脾鐵蛋白的空腔內(nèi)合成了磁性鐵核，這項工作開辟了納米顆粒仿生合成的新領(lǐng)域。2006年M.Uchida[12]實驗室利用原核表達系統(tǒng)重組表達人H-鐵蛋白，并在獲得的鐵蛋白外殼內(nèi)仿生合成了磁性鐵蛋白。該方法簡化了鐵蛋白的仿生合成步驟，極大地推動了鐵蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。鐵蛋白天然結(jié)構(gòu)的物理性質(zhì)穩(wěn)定，能夠耐受高溫和多種變性劑[13-14]，但是對pH敏感。鐵蛋白外殼在pH 2.0 的酸性條件下解體，但在pH 恢復(fù)到生理條件(pH 7.0)時，又能重新組裝成天然結(jié)構(gòu)的鐵蛋白[15-16]，利用這種特性人們可以對鐵蛋白納米結(jié)構(gòu)的外表面、內(nèi)表面或鐵內(nèi)核進行選擇性的修飾。鐵蛋白外殼不僅可以通過化學(xué)方法進行修改，而且還可以進行基因工程修飾。2006年，美國新世紀(jì)醫(yī)藥公司(New Century Pharmaceuticals)在鐵蛋白L 亞基的N 端融合表達HIV 病毒的Tat 肽段，表達所得的蛋白具有鐵蛋白納米結(jié)構(gòu)，并可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答[17]。2013年，NIH 過敏與傳染病研究所的疫苗研究中心又通過將流感病毒血凝素HA與幽門螺桿菌鐵蛋白亞基N端融合，用這種鐵蛋白免疫雪貂成功產(chǎn)生中和抗體。同時還發(fā)現(xiàn)，這種鐵蛋白疫苗顯著的增加了疫苗的廣譜性，且對動物內(nèi)源鐵蛋白不產(chǎn)生免疫反應(yīng)[18]。此后，鐵蛋白納米結(jié)構(gòu)在抗原呈遞等醫(yī)藥相關(guān)研究中迅速升溫。韓國納米生物科學(xué)與化工學(xué)院利用鐵蛋白作為基于樹突狀細(xì)胞疫苗的抗原呈遞平臺[19]。Y.C.Chiu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白納米載體在抗原呈遞過程中可以通過改變抗原與免疫細(xì)胞的相互作用而增強免疫效果。

原核表達系統(tǒng)是目前研究最為成熟的表達系統(tǒng)，在外源蛋白表達領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[21]。本研究參考M.Kanekiyo等[18]使用的HelicobacterPylorinonheme iron-containing Ferritin 蛋白序列，并按照大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，通過原核表達系統(tǒng)表達并純化得到重組Ferritin蛋白，為其作為納米載體在藥物與抗原呈遞中的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

本試驗所用內(nèi)切酶購自New England Biolabs (NEB)，配制緩沖液的試劑除特殊說明均為國產(chǎn)分析純。試驗所用克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans 5α和表達感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)均購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。試驗所涉及到的引物合成及DNA測序均由上海生工生物工程有限公司完成。超螺旋DNA marker (Supercoiled DNA marker)購買自TaKaRa，DNA marker Ⅲ 購買自北京天根生化科技有限公司。

1.2 pET-32a-Ferritin原核表達載體構(gòu)建

按大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化過的HelicobacterPylorinonheme iron-containing Ferritin 蛋白序列(WP_000949190.1)于上海生工生物工程有限公司合成并克隆于pMD-18T載體上。Ferritin全長502 bp，按照fast-fusion克隆試劑盒(FFPC-C020，GeneCopoeia)說明書在目的基因兩端設(shè)計同源臂，并在同源臂和目的基因之間添加酶切位點(表1，斜體下劃線處)。將Ferritin基因定向插入至pET-32a(+)載體多克隆位點區(qū)XhoI 和BamH I酶切位點之間，得到pET-32a-Ferritin原核表達載體(圖1)。提取菌液PCR陽性菌株的質(zhì)粒(天根生化科技有限公司，北京)，用XhoI 和BamH I內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

表1pET32a-Ferritin載體克隆引物

Table1PrimersofpET32a-Ferritinvectorforfast-fusion

名稱Name序列(5'→3')Sequence退火溫度/℃Tm擴增長度/bpProductlengthpET32a-FerritinFRTGGCTGATATCGGATCCATGCTGTCTAAAGACATCGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGATTTACGAGATT60502

圖1 Ferritin原核表達載體構(gòu)建Fig.1 Prokaryotic expression vector construction of Ferritin

1.3 Ferritin蛋白誘導(dǎo)表達

將鑒定后的陽性菌液按1∶50比例接種于10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)4 h，然后加入IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1(保留1管菌液不加誘導(dǎo)劑以作陰性對照)，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。分別取1 mL菌液，4 ℃ 12 000 r·min-1離心2 min收集菌體，加入75 μL RIPA裂解液和25 μL 4×上樣緩沖液，混勻沸水煮10 min后，冰浴10 min。然后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清，使用Bio-Rad Stain-Free試劑盒進行10% SDS-PAGE電泳。

1.4 Ferritin蛋白表達形式鑒定

收集100 mL陽性菌液，12 000 r·min-1離心5 min，用PBS洗滌2次后在沉淀中加入預(yù)冷的細(xì)菌裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 500 mmol·L-1NaCl, 0.1 mmol·L-1PMSF, 5 mmol·L-1EDTA, 1 mg·mL-1溶菌酶)，重懸菌體，冰上消化30 min。之后于冰浴中超聲波破碎菌體(400 W，2 s，2 s，30 min)，至菌液不再黏稠時即可停止。取50 μL菌液作為混合液樣品，另外取出1 mL菌液4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。分別收取50 μL上清及沉淀制作可溶蛋白及包涵體樣品。分別取混合液，上清及沉淀使用Bio-Rad Stain-Free 試劑盒進行10% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后使用ChemiDoc?MP-Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。然后用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。然后將硝酸纖維素膜用5% 脫脂牛奶(TBS-T配制)封閉2 h，之后用TBS-T洗滌3次，并用TBS清洗1次。然后加入His標(biāo)簽一抗(1∶10 000，武漢三鷹)于4 ℃孵育過夜。次日再用TBS-T洗滌3次，TBS洗滌1次，然后用HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h。最后再用TBS-T洗滌3次，并用TBS清洗1次，用增強型ECL(15049A2，Millipore)顯色液進行顯色拍照。

1.5 His-Ferritin融合蛋白的親和層析

取pET-Ferritin陽性菌液300 mL，按照上述方法制作包涵體樣品，加入預(yù)冷的包涵體洗滌緩沖液，進行超聲洗滌(400 W，2 s，3 s，10 min)2次，之后4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min，收集包涵體，加入結(jié)合緩沖液冰上溶解。溶解后的包涵體經(jīng)離心，過濾之后使用His-Trap HP層析柱及AKTA avant儀器進行親和層析，咪唑線性濃度梯度進行洗脫(咪唑濃度從20 mmol·L-1線性上升至500 mmol·L-1)，收集各段洗脫液進行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白His-Ferritin的純度。

1.6 蛋白的復(fù)性和組裝

由于將變性蛋白直接透析至不含尿素的緩沖液時，蛋白質(zhì)很容易析出沉淀，而透析至含有2 mol·L-1脲的相同緩沖液中無沉淀產(chǎn)生[22]。因此將純化后的His-Ferritin 蛋白使用Hiprep 26/10(GE healthcare)脫鹽柱梯度置換至2 mol·L-1脲的復(fù)性緩沖液(2 mol·L-1尿素，50 mmol·L-1PBS，pH 8.0)，并于4 ℃放置過夜。然后將蛋白置換至50 mmol·L-1PBS，pH 8.0 緩沖液，4 ℃存放。復(fù)性后的蛋白用superdex 75 分子篩檢測蛋白復(fù)性效果。

1.7 His-Ferritin融合蛋白納米結(jié)構(gòu)電鏡觀察

取10 μL復(fù)性后的蛋白質(zhì)滴加到干凈塑料紙上制作微滴，將150 目銅網(wǎng)支持膜貼在液滴上吸附3～5 min，用濾紙吸去多余的樣品，然后滴加蒸餾水清洗銅網(wǎng)表面并用濾紙吸去多余液體。最后將銅網(wǎng)放置在2%磷鎢酸液滴中進行染色2 min，用濾紙吸去多余染色液后晾干銅網(wǎng)，使用日立HT7700 透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 pET-32a-Ferritin原核表達載體構(gòu)建

通過同源重組連接得到大小為6 402 bp的pET-32a-Ferritin重組表達載體，對重組原核表達質(zhì)粒進行雙酶切(BamH I+XhoI)鑒定，可見約502 bp的Ferritin片段及5 900 bp的載體片段(圖2)，大小均與理論值相同。

M1. 超螺旋 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET-32a-Ferritin 質(zhì)粒；2. pET-32a-Ferritin酶切后片段；M2. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M1. Supercoiled DNA marker; 1. pET-32a-Ferritin plasmid；2. pET-32a-Ferritin enzymatic digestion fragment；M2. DNA marker Ⅲ圖2 重組質(zhì)粒pET-32a-Ferritin的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-32a-Ferritin by double enzyme digestion

2.2 His-Ferritin融合蛋白誘導(dǎo)表達及表達形式

重組原核表達質(zhì)粒pET-32a-His-Ferritin 共編碼332個氨基酸(包括His標(biāo)簽等表達元件在內(nèi))，理論大小約為36.9 ku。10% SDS-PAGE電泳及Western-blot分析顯示，IPTG誘導(dǎo)后有一個約為37 ku蛋白出現(xiàn)過表達(圖3A)。使用His標(biāo)簽抗體進行Western-blot 試驗，結(jié)果顯示，約在37 ku處有一條特異性條帶，表明誘導(dǎo)出的蛋白確為His-Ferritin融合蛋白(圖3B)。同時，可溶性分析結(jié)果顯示，His-Ferritin融合蛋白主要以包涵體形式表達。

2.3 His-Ferritin融合蛋白的親和層析純化及SDS-PAGE分析

選用His-Trap HP 層析柱對變性蛋白質(zhì)進行親和層析純化，使用96孔深孔板對梯度洗脫過程中的洗脫產(chǎn)物進行完全收集，并選擇有代表性的樣品進行SDS-PAGE電泳分析。A1-E4對應(yīng)96孔收集板不同的收集孔，分別對應(yīng)不同濃度咪唑洗脫樣品(96孔板豎排標(biāo)記A～E，橫排標(biāo)記1～12)。結(jié)果顯示，咪唑線性梯度洗脫可以特異性的獲得目標(biāo)蛋白，融合蛋白在咪唑濃度為190 mmol·L-1時出現(xiàn)單一洗脫峰(圖4A)。用SDS-PAGE 對穿透峰及不同濃度咪唑的洗脫產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，目的蛋白主要存在于洗脫峰處的洗脫液中，純度達96%(圖4B)。在洗脫峰處可見約37 和105 ku的2條蛋白條帶，說明在純化過程中有少量目標(biāo)蛋白復(fù)性自組裝為三聚體結(jié)構(gòu)。

A. SDS-PAGE膠驗證重組蛋白表達；B. Western-blot 驗證重組蛋白表達。M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白；2. IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌總蛋白；3. IPTG誘導(dǎo)表達大腸桿菌總蛋白可溶組分；4. IPTG誘導(dǎo)表達大腸桿菌包涵體組分A. SDS-PAGE verifying the expression of His-Ferritin；B. Western-blot verifying the expression of His-Ferritin. M. Protein marker；1. Total protein of E.coli without induction；2. Total protein of E.coli after IPTG induction；3. Soluble protein of E.coli after IPTG induction；4. Inclusion body of E.coli after IPTG induction圖3 His-Ferritin融合蛋白誘導(dǎo)表達及表達形式分析Fig.3 Expression of His-Ferritin fusion protein and soluble analysis

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); S. 重組蛋白樣品；A1～E4. 不同濃度咪唑洗脫樣品M. Protein marker；S. Recombinant protein sample；A1-E4. Imidazole elution samples with different concentrations圖4 His-Ferritin融合蛋白的親和層析純化(A)及SDS-PAGE分析(B)Fig.4 Affinity chromatography purification(A) and SDS-PAGE analysis (B) of fusion protein His-Ferritin

2.4 重組蛋白復(fù)性及胞外自組裝

為使純化得到的蛋白進行充分的復(fù)性及自組裝，將純化后的His-Ferritin 蛋白梯度置換至2 mol·L-1尿素的復(fù)性緩沖液放置于4 ℃ 過夜，Superdex75 檢測發(fā)現(xiàn)融合蛋白在外水體積出峰，說明大多數(shù)蛋白呈現(xiàn)為大分子量復(fù)合體，即在體外完成復(fù)性及自組裝(圖5A)。采用透射電子顯微鏡觀察復(fù)性后的蛋白質(zhì)樣品，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)為均勻的納米級顆粒，粒徑約為12～20 nm(圖5B)。

A. 重組蛋白分子量和純度分析；B. 透射電鏡分析重組蛋白納米結(jié)構(gòu)A. Molecular weight and purity analysis of recombinant protein；B. Transmission electron microscope analysis of nano-structure of recombinant protein圖5 重組蛋白復(fù)性與胞外自組裝Fig.5 Refolding and self-assembling in vitro of recombinant protein

3 討 論

生物納米技術(shù)的眾多優(yōu)勢使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。高小龍等[23]利用原核表達系統(tǒng)等篩選得到了新城疫病毒F蛋白納米抗體。鐵蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，具有良好的生物安全性，其獨特的理化性質(zhì)使其成為理想的納米載體，目前已廣泛用于腫瘤檢測與靶向治療以及多種癌癥預(yù)后指標(biāo)[24-26]。T.R.Daniels等[25]研究發(fā)現(xiàn)，人鐵蛋白重鏈?zhǔn)荏w(TfR1)在腫瘤細(xì)胞中的表達量提高了100 倍，因此鐵蛋白納米顆?？梢宰鳛槟[瘤標(biāo)志分子，并通過修飾攜帶藥物以TfR1為靶標(biāo)，從而達到靶向治療的效果。許婉芳等[27]利用原核表達系統(tǒng)得到了重組人鐵蛋白，為其在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。此外，由于鐵蛋白內(nèi)核Fe3O4具有超順磁性，使其可以發(fā)展為MRI 顯影劑。有學(xué)者甚至研究通過使體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞過表達H-鐵蛋白，并直接應(yīng)用核磁共振實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤成像和淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的檢測[7,28]。然而, 人們對于鐵蛋白與腫瘤關(guān)系的認(rèn)識, 目前多是源于發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)異常表達，其在腫瘤形成過程中的具體功能和機制還有待進一步研究。同時，由于鐵蛋白在免疫調(diào)控和炎癥發(fā)生等多方面均有著重要的作用，目前還無法確定體內(nèi)直接過表達鐵蛋白的安全性。而且由于鐵蛋白在各組織器官中廣泛表達，過表達的鐵蛋白信號容易受到內(nèi)源性鐵蛋白背景信號的干擾，從而不易于獲得明確的檢測信號。因此，使用外源鐵蛋白作為疾病診斷和治療的研究近年來成為一種趨勢。M.Kanekiyo等[18]研究表明，使用幽門螺桿菌鐵蛋白與流感病毒血凝素HA融合表達免疫動物后不會引起機體內(nèi)源性蛋白的免疫反應(yīng)。本研究通過原核表達獲得了與人類鐵蛋白H鏈同源性為46%的幽門螺桿菌的鐵蛋白，純化及復(fù)性過程中采用將Ferritin蛋白先變性純化，然后透析至2 mol·L-1脲復(fù)性，再透析至PBS的方案，降低目標(biāo)蛋白形成不規(guī)則多聚體的幾率，使目標(biāo)蛋白可以正確折疊為納米粒子，由于該蛋白為外源蛋白，作為納米載體應(yīng)用于體內(nèi)時理論上不會引起免疫系統(tǒng)針對自身鐵蛋白的免疫反應(yīng)，更加有利于鐵蛋白納米粒子在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

對蛋白類藥物而言，相對于化學(xué)修飾，采用基因工程方法將目標(biāo)蛋白與鐵蛋白亞基融合表達的方法解決了在化學(xué)標(biāo)記時標(biāo)記蛋白方向的隨機性降低檢測靈敏度的問題。而通過將標(biāo)記蛋白與鐵蛋白亞基融合表達，使融合蛋白有序的展示在鐵蛋白殼的外表面，提高抗體或藥物等目標(biāo)蛋白的載量和效率。中國科學(xué)院生物物理研究所開發(fā)的攜帶阿霉素的H-鐵蛋白，通過單次注射即可特異性結(jié)合并殺死癌細(xì)胞[29]。在鐵蛋白L 亞基的N 端融合表達HIV 病毒的Tat 肽段，并用自組裝納米疫苗口服免疫小鼠引起高效的免疫應(yīng)答[17]。韓國蔚山國家科學(xué)技術(shù)研究所研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白可以將OT-1和OT-2肽段成功的呈遞于樹突狀細(xì)胞，并在體內(nèi)和體外都可以誘導(dǎo)T細(xì)胞抗原特異性因子CD4和CD8的增殖[19]。本研究所使用的鐵蛋白包涵體分離純化及胞外復(fù)性自組裝方法使鐵蛋白可以在體外自組裝為具有納米結(jié)構(gòu)的鐵蛋白納米粒子，該方法同樣適用于其他蛋白與鐵蛋白進行融合表達的純化與胞外自組裝。

4 結(jié) 論

本研究通過原核表達系統(tǒng)成功表達并純化得到了具有天然納米結(jié)構(gòu)的鐵蛋白，該鐵蛋白粒徑均一，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以通過化學(xué)修飾用于藥物呈遞載體，也可以通過與蛋白類藥物或抗原等融合表達，直接用于新型藥物或疫苗的研發(fā)，為鐵蛋白納米粒子在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與應(yīng)用提供參考。

[1] LAUFBERGER V. Sur la cristallisation de la ferritine[J].BullSocChimBiol, 1937, 19: 1575-1582.

[2] THEIL E C, BEHERA R K, TOSHA T. Ferritins for chemistry and for life[J].CoordChemRev, 2013, 257(2): 579-586.

[3] THEIL E C. Ferritin protein nanocages-the story[J].NanotechnolPercept, 2012, 8(1): 7-16.

[4] HARRISON P M, AROSIO P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation[J].BiochimBiophysActa, 1996, 1275(3): 161-203.

[5] COZZI A, CORSI B, LEVI S, et al. Overexpression of wild type and mutated human ferritin H-chain in HeLa cells:invivorole of ferritin ferroxidase activity[J].JBiolChem, 2000, 275(33): 25122-25129.

[6] ANDREWS N C. Forging a field: the golden age of iron biology[J].Blood, 2008, 112(2): 219-230.

[7] COHEN B, ZIV K, PLAKS V, et al. Ferritin nanoparticles as magnetic resonance reporter gene[J].WileyInterdiscipRevNanomedNanobiotechnol, 2009, 1(2): 181-188.

[8] 李志鵬, 劉慶友, 石德順. 鐵蛋白納米顆粒應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2015, 31(10): 38-47.

LI Z P, LIU Q Y, SHI D S. Research progress on application of ferritin nanoparticles in the field of biomedicine[J].BiotechnologyBulletin, 2015, 31(10): 38-47. (in Chinese)

[9] TOWE K M. Structural distinction between ferritin and iron-dextran (imferon). An electron diffraction comparison[J].JBiolChem, 1981, 256(18): 9377-9378.

[10] MELDRUM F C, WADE V J, NIMMO D L, et al. Synthesis of inorganic nanophase materials in supramolecular protein cages[J].Nature, 1991, 349(6311): 684-687.

[11] MANN S, ARCHIBALD D D, DIDYMUS J M, et al. Crystallization at inorganic-organic interfaces: biominerals and biomimetic synthesis[J].Science, 1993, 261(5126): 1286-1292.

[12] UCHIDA M, FLENNIKEN M L, ALLEN M, et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles[J].JAmChemSoc, 2006, 128(51): 16626-16633.

[13] SANTAMBROGIO P, PINTO P, LEVI S, et al. Effects of modifications near the 2-, 3- and 4-fold symmetry axes on human ferritin renaturation[J].BiochemJ, 1997, 322(Pt 2): 461-468.

[14] STEFANINI S, CAVALLO S, WANG C Q, et al. Thermal stability of horse spleen apoferritin and human recombinant H apoferritin[J].ArchBiochemBiophys, 1996, 325(1): 58-64.

[15] KANG S, OLTROGGE L M, BROOMELL C C, et al. Controlled assembly of bifunctional chimeric protein cages and composition analysis using noncovalent mass spectrometry[J].JAmChemSoc, 2008, 130(49): 16527-16529.

[16] UCHIDA M, KANG S, REICHHARDT C, et al. The ferritin superfamily: supramolecular templates for materials synthesis[J].BiochimBiophysActa, 2010, 1800(8): 834-845.

[17] LI C Q, SOISTMAN E, CARTER D C. Ferritin nanoparticle technology... A new platform for antigen presentation and vaccine development[J].IndBiotechnol, 2006, 2(2): 143-147.

[18] KANEKIYO M, WEI C J, YASSINE H M, et al. Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies[J].Nature, 2013, 499(7456): 102-106.

[19] HAN J A, KANG Y J, SHIN C, et al. Ferritin protein cage nanoparticles as versatile antigen delivery nanoplatforms for dendritic cell (DC)-based vaccine development[J].NanomedNanotechnolBiolMed, 2014, 10(3): 561-569.

[20] CHIU Y C, GAMMON J M, ANDORKO J I, et al. Assembly and immunological processing of polyelectrolyte multilayers composed of antigens and adjuvants[J].ACSApplMaterInterface, 2016, 8(29): 18722-18731.

[21] 薛茂云, 董 飚, 張 營, 等. 鴨脂聯(lián)素基因全長cDNA的克隆和原核表達的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2010, 41(10): 1232-1239.

XUE M Y, DONG B, ZHANG Y, et al. Identification and prokaryotic expression of duckAdiponectingene[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2010, 41(10): 1232-1239. (in Chinese)

[22] 薛 玲, 劉江寧, 張 耀, 等. EV71多表位抗原親和純化及類病毒顆粒胞外自組裝[J]. 中國生物工程雜志, 2016, 36(7): 34-40.

XUE L, LIU J N, ZHANG Y, et al. Affinity purification of enterovirus 71 fused multi-epitope protein antigen and assembling it as virus-like particlesinvitro[J].ChinaBiotechnology, 2016, 36(7): 34-40. (in Chinese)

[23] 高小龍, 胡湘云, 付向晶, 等. 新城疫病毒F蛋白納米抗體的篩選及活性鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2016, 47(8): 1645-1651.

GAO X L, HU X Y, FU X J, et al. Screening and characterization of VHH against newcastle disease virus fusion protein[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2016, 47(8): 1645-1651. (in Chinese)

[24] 黃培森, 沈 陽, 王焦清, 等. 鐵蛋白納米粒子的修飾及細(xì)胞內(nèi)化特性的研究[J]. 化學(xué)試劑, 2015, 37(1): 8-12.

HUANG P S, SHEN Y, WANG J Q, et al. Modified ferritin-based nanoparticles and internalizationin cells[J].ChemicalReagents, 2015, 37(1): 8-12. (in Chinese)

[25] DANIELS T R, DELGADO T, HELGUERA G, et al. The transferrin receptor part II: targeted delivery of therapeutic agents into cancer cells[J].ClinImmunol, 2006, 121(2): 159-176.

[26] REISSMANN K R, DIETRICH M R. On the presence of ferritin in the peripheral blood of patients with hepatocellular disease[J].JClinInvest, 1956, 35(6): 588-595.

[27] 許婉芳, 陳 曦, 陳巧君. 人鐵蛋白基因的克隆與原核表達[J]. 泉州師范學(xué)院學(xué)報, 2011, 29(4): 45-49.

XU W F, CHEN X, CHEN Q J. Cloning and expression of theFerritingene inHomosapiens[J].JournalofQuanzhouNormalUniversity, 2011, 29(4): 45-49. (in Chinese)

[28] GILAD A A, WINNARD P T JR, VAN ZIJL P C M, et al. Developing MR reporter genes: promises and pitfalls[J].NMRBiomed, 2007, 20(3): 275-290.

[29] LIANG M M, FAN K L, ZHOU M, et al. H-ferritin-nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target and kill tumors with a single-dose injection[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2014, 111(41): 14900-14905.