山羊DCT基因啟動子活性區(qū)及其轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控探究

劉春楊，張樂超，王 麒，周榮艷，李蘭會*，李祥龍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071000； 2.河北科技師范學院，秦皇島 066004)

定位于黑素體膜上的跨膜蛋白—多巴色素異構(gòu)酶 (Dopachrometautomerase，DCT)，也稱作酪氨酸酶相關(guān)蛋白2 (TYRP2)，參與黑色素的生物合成過程[1-2]，1992 年被確認為酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族的第3個成員，具有多巴色素異構(gòu)酶(DT)活性，催化多巴色素轉(zhuǎn)變?yōu)?, 6-二羥基吲哚羧酸( DHICA)，具有加速黑色素生成的作用。黑色素細胞中的DCT基因控制著5, 6-二羥基吲哚羧酸與5,6-二羥基吲哚(DHI)的比例，因此推測，DCT可能對黑色素合成早期階段的酪氨酸酶催化活性有調(diào)節(jié)作用，對動物毛色形成發(fā)揮重要作用[3-4]。而且，由于中間產(chǎn)物DHI在體內(nèi)比DHICA有更高的細胞毒性，DCT能使含有羧酸前體的DHICA迅速摻入生物合成的黑色素內(nèi)，對減少中間產(chǎn)物的細胞毒性有重要意義[5-6]。據(jù)前人研究，DCT基因單堿基變異的小鼠，與野生型黑色小鼠相比，DCT活性降低了3～4倍，從而產(chǎn)生了深灰或深棕色小鼠[7]。DCT基因突變的小鼠黑色素細胞過早死亡，可能是由于 DCT 缺失而產(chǎn)生的細胞毒性中間體所致[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除DCT第一外顯子后導致DCT基因mRNA和蛋白質(zhì)表達量缺失，影響了黑色素細胞的活性和色素沉著，形成深灰色被毛[9]。

鑒于DCT基因表達在動物毛色和生命活動中的重要作用，其表達水平受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[10-11]，因此，研究DCT基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理對于揭示動物毛色形成具有重要作用。SOX10是調(diào)控DCT基因表達的一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子[12]，體外試驗表明，SOX10能夠激活DCT基因啟動轉(zhuǎn)錄[13-14]。MITF也是黑色素合成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，有研究認為，DCT基因的表達是依靠MITF與SOX10兩種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活的[15-16]，也有研究認為，DCT可能存在不依賴于MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[17-19]。人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外試驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子OTX2能夠結(jié)合到DCT基因的啟動子區(qū)，抑制內(nèi)源OTX2的表達導致DCT蛋白含量的減少，說明OTX2能夠激活DCT基因啟動子[20]。

本試驗克隆山羊DCT基因5′UTR區(qū)序列，并構(gòu)建DCT基因系列缺失片段的pGL3-Basic重組質(zhì)粒，利用點突變方法構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子SOX10、MITF和OTX2結(jié)合位點突變的DCT基因系列重組質(zhì)粒，以Luciferase報告基因系統(tǒng)檢測重組質(zhì)粒的啟動活性變化，明確該基因啟動子核心調(diào)控區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子對DCT基因的表達調(diào)控，以期為山羊DCT基因的表達調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pGL3-Basic 與 pRL-TK 載體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒為美國 Promega 公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine?2000 Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；Opti-MEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；TransStartTaqDNA 聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、點突變試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品；感受態(tài)細胞DH5α、膠回收試劑盒為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；閃電克隆試劑盒為北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，測序由北京六合華大基因公司完成。

績效管理工作的有效推進可以很大程度上激發(fā)工作人員的工作積極性，并保證全部管理活動能夠在績效管理體系建設的過程中實現(xiàn)更大的價值。

1.2 試驗方法

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的山羊DCT基因系列缺失片段與線性化載體進行連接重組，反應體系：目的片段400 ng，載體20 ng，2×Lightening Cloning Master Mix 5 μL，ddH2O補足至10 μL，50 ℃水浴1 h。將反應液轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，鑒定為陽性的單菌落送公司測序，確定為陽性克隆，進一步進行重組質(zhì)粒的大量提取。

根據(jù)點突變試劑盒說明書，應用PCR方法實現(xiàn)堿基突變。PCR反應體系：原質(zhì)粒載體DNA 20～50 ng，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，退火溫度退火20 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃終止反應。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有目的條帶，加1 μL DMT酶于10 μL PCR產(chǎn)物中，37 ℃消化孵育1 h。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μL DMT感受態(tài)細胞中，涂布到含氨芐的培養(yǎng)皿，挑取單菌落，送至華大測序。成功實現(xiàn)突變的載體進行質(zhì)粒的大量提取，為轉(zhuǎn)染做準備。

利用特異引物(表1)擴增山羊DCT基因上游序列5′端缺失片段，分別命名為P1、P2、P3、P4和P5。根據(jù)第一輪啟動子預測片段活性值，以P3片段序列為模板，設計一系列3′端缺失序列引物，分別命名為P6、P7、P8、P9、P10和P11。

表1山羊DCT基因啟動子擴增引物

Table1PrimersamplifyinggoatDCTgenepromoterswithdifferentlength

小寫字母為與載體的重疊區(qū)序列；下劃線標記為所用酶切位點；大寫字母為引物特異性序列

Lowercase letters are overlap regions with the vectors; underlined letters are restriction enzyme digestion sites; uppercase letters are the specifical primer sequences

1.2.2 山羊DCT基因啟動子系列缺失片段的克隆 PCR反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2.5 μL，TransStartTaq酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，最后ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸0.5～2 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃終止反應。利用1%瓊脂糖凝膠對 PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，若條帶單一且為目的條帶，直接進行PCR產(chǎn)物純化，若條帶復雜但含有目的條帶，將PCR產(chǎn)物進行切膠純化回收處理。

1.2.3 載體質(zhì)粒的線性化 根據(jù)設計引物時所加酶切位點，利用SacI和XhoI兩種限制性內(nèi)切酶將載體pGL3-Basic進行雙酶切處理，實現(xiàn)載體的線性化。載體雙酶切體系：載體質(zhì)粒1 500 ng，10×M Buffer 6 μL，SacI和XhoI各1.5 μL，H2O補足至60 μL，37 ℃反應3～4 h，將反應液進行切膠回收。

基于對青少年自我價值感及道德判斷能力與價值觀關(guān)系的研究，在自我價值感中，自我觀與人際情感之間具有正向關(guān)系，其他則為負向。換言之，自我觀越重的學生，其自我價值感越強，并以此更加關(guān)注自身的成長，形成良性循環(huán)。與此同時，群體觀與自我價值感卻存在著互相關(guān)聯(lián)，自我觀強導致群體觀低、人際價值感高。

1.2.1DCT基因啟動子系列缺失片段引物設計 以山羊DCT基因序列(NCBI收錄號：NC_030819.1)為模板，利用在線引物設計程序NEBuilder(http://nebuilder.neb.com/)設計特異引物，在上游引物5′端引入SacI的酶切位點及部分與表達載體的重疊區(qū)，下游引物5′端引入XhoI的酶切位點及部分與表達載體的重疊區(qū)。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變載體的構(gòu)建 利用轉(zhuǎn)錄因子在線分析軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)對啟動子活性值最高的片段進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析。根據(jù)不改變DCT基因其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的原則，按照點突變說明書，對啟動子活性值最高片段設計突變轉(zhuǎn)錄因子SOX10、MITF和OTX2結(jié)合位點的引物，命名為TB1、TB2、TB3、TB4、TB5和TB6(表2)。TB1將-846和-845 bp位置GT突變?yōu)門A，TB2將-617 和-616 bp位置GT突變?yōu)镃A，而TB3將-604和-603 bp位置CA突變?yōu)锳G，從而使三者的SOX10結(jié)合位點消失。TB4將-410 bp的C突變?yōu)锳，TB5將-310 bp的C突變?yōu)锳，使MITF結(jié)合位點消失。TB6將-277 bp的A突變成C，使轉(zhuǎn)錄因子OTX2結(jié)合位點消失。

表2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變引物

Table2Primersofpointmutationintranscriptionfactorbindingsite

引物Prim-er轉(zhuǎn)錄因子TFs上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimer退火溫度/℃TmTB1SOX10AGTCTGTCCAACCCTTTTAGACC-CCGTGGTAAAAGGGTTGGACAGACTGAA-ATGACT59TB2SOX10GAAGAGGATCCCTCATCATGAAC-TGTGAATGATGAGGGATCCTCTTCTCTC-CAAAGA59TB3SOX10ATTGTGAACTGTGAAAAGAAGCA-ATTCCTCTTTTCACAGTTCACAATGAG-GGATCCT59TB4MITFTAGGAAGTCTGAGGTAACAAGCTTGGTACCTCAGACTTCCTAGGGAGTCAA58TB5MITFTTGTGCGCTCTGGGTAATGTGCTAACTACCCAGAGCGCACAATGAAGTAGA59TB6OTX2ATTTGTCTAATACTACTCCTGCTAATGTAGTATTAGACAAATCCCCATCGT53

下劃線處為突變堿基

Underlined letters are mutant bases

從“宏大敘事”轉(zhuǎn)向“微小敘事”—從英雄、模范的典型事跡轉(zhuǎn)向平民百姓的生活事件；從隱身敘事轉(zhuǎn)到自傳敘事—從講述別人的故事到自己“親歷”的故事；從“社會劇本”轉(zhuǎn)到“生活劇本”—把學生當下身邊發(fā)生的道德事件作為教材的出發(fā)點，發(fā)現(xiàn)細微小事和典型事例中隱藏的道德智慧。

風險投資在近年“共享經(jīng)濟”的飛速發(fā)展中被人所熟知，是投資中介向特別有潛能的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)投入風險資本后，實現(xiàn)利益共享、風險共擔的一種投資方式。大學生創(chuàng)業(yè)遇到的最大問題就是資金不足。以Dormi為例，在校創(chuàng)業(yè)階段，有政府提供的項目資金與學校舉辦相關(guān)活動的獎金。在轉(zhuǎn)型進入更大市場時，依靠前期盈利與創(chuàng)始團隊家庭支持是不夠的，必須尋求社會資金的幫助。對于風險投資公司來說，他們也希望尋找到有發(fā)展?jié)摿Φ闹行⌒晚椖?，通過早期“資本換股權(quán)”，從而在未來公司成熟后以更高價格將股權(quán)賣出獲得收益[2]。

顛覆潮流，打破“長”規(guī)，全新梅賽德斯-奔馳長軸距A級轎車以實力向世人揭示—這才是新生代豪華轎車該有的樣子！此次上市車型包括全新A 180 L轎車及運動轎車、全新A 200 L轎車及運動轎車，以及全新A 200 L運動轎車先型特別版共 5款車型，廠商建議零售價格區(qū)間為人民幣21.69萬元至29.99萬元。

2 結(jié) 果

2.1 山羊DCT基因啟動子區(qū)調(diào)控元件分析

NCBI數(shù)據(jù)庫中下載山羊DCT基因(NC_030819.1)，并與人和鼠DCT基因啟動子序列相比，山羊DCT基因的-648～+73 bp(外顯子1第1個堿基記為+1)區(qū)域與人的相似度達81%，-472～-28 bp區(qū)域與鼠DCT基因啟動子序列相似度達78%。

對目的序列進行啟動子特征分析，發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控元件(圖1)：包含6個TATA box，分別位于-382～-366 bp、-337～-321 bp、-205～-189 bp、-187～-172 bp、-125～-109 bp和+774～+790 bp；位于-138～-123 bp的GC box；位于-188～-175 bp 的CAAT box；位于-313～-303 bp的M box和位于-620～-588 bp 的32 bp元件。

圖1 山羊DCT基因序列特征圖Fig.1 Sequence feature of goat DCT gene

利用在線程序Meth Primer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) 對山羊DCT基因-2 000～+1 000 bp序列進行CpG島預測分析，參數(shù)設置為Island size ≥100，Obs/Exp ≥0.6，GC Percent ≥50.0。在3 000 bp的序列中，共存在2處CpG島，分別位于該基因的-93～+7 bp和+309～+603 bp(圖1)。

1.2.6 山羊DCT基因啟動子活性檢測 A375細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在 5% CO2和 37 ℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔1.5×105個細胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板，以不含血清及抗生素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當細胞融合度達到90%，根據(jù)Lipofectamine?2000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明開始轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體與質(zhì)?？偭勘壤秊?∶1，pGL3-promoter質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染比例為19∶1。轉(zhuǎn)染后 48 h 裂解細胞，利用雙熒光素酶檢測試劑盒，GloMax-MultiJr 單管型多功能檢測儀檢測熒光素酶活性。

利用Promoter 2.0預測山羊DCT基因-801、-501和+200 bp 3個位置為啟動子位置，分值分別為0.657、0.692和0.621。

2.2 山羊DCT基因啟動子缺失片段載體的構(gòu)建

5′和3′系列缺失序列片段的PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖2，可見目的條帶單一，亮度清晰，無雜帶。圖2中P1、P2、P3、P4和P5片段分別長2 059、1 598、1 222、775和436 bp，P6、P7、P8、P9、P10和P11片段分別長1 024、778、728、690、650和356 bp。

將PCR產(chǎn)物純化回收，與線性化表達載體混合，加入重組酶，使目的片段與線性化表達載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，陽性克隆送華大公司測序，測序結(jié)果與預期結(jié)果一致，證明重組載體構(gòu)建成功。

(4)借助社會專業(yè)力量，對企業(yè)進行流程進行梳理，提升核心競爭力。國家有一整套完善的《企業(yè)內(nèi)部控制規(guī)范》屬理論范疇，指引企業(yè)內(nèi)部風險控制。但是，企業(yè)內(nèi)控成本與企業(yè)實際工作的有效結(jié)合，成本效益原則的尺度不好掌握。往往造成的結(jié)果是高成本全覆蓋，有事大家都有責，沒人擔當，沒有責任人，也沒有經(jīng)濟成果，無為就無責。企業(yè)應以實際經(jīng)營工作及流程為出發(fā)點，聘請社會專業(yè)力量，對企業(yè)流程進行梳理，縮短管理鏈條，根據(jù)重要性原則和關(guān)鍵節(jié)點實施有效控制，有法滿足的實施替代內(nèi)控復核程序，提升管理效率，找到成本與效益的最佳結(jié)合點，實現(xiàn)國有企業(yè)的價值最大化。

2.3 重組質(zhì)粒啟動子活性分析

雖然P9片段的基本調(diào)控元件與P10片段相同，但P9卻表現(xiàn)出極顯著高于P10的啟動子活性(P<0.01)，說明-232～-192 bp間存在重要調(diào)控元件，1個TATA box(-205～-189 bp)，增加DCT基因的轉(zhuǎn)錄活性。P8片段增加1個TATA box(-187～-172 bp)和1個CAAT框(-188～-175 bp)，其活性表現(xiàn)為最高，比陰性對照高出20.26倍，極顯著高于其它所有片段(P<0.01)，推測-192～-154 bp間的CAAT box為DCT基因的關(guān)鍵調(diào)控元件，發(fā)揮增強子作用。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標準；P1～P11. 系列缺失片段M. DNA marker; P1-P11. The series of deleted fragments圖2 DCT基因系列缺失片段PCR產(chǎn)物凝膠檢測圖Fig.2 Agarose gel electropherogram of PCR products of the serial deleted fragments of DCT gene

不同片段顯示出不同的熒光活性，說明啟動子不同區(qū)域存在不同作用的重要調(diào)控元件。由P5、P4至P3片段長度增加，啟動子活性逐漸增加推測，山羊DCT基因核心啟動子區(qū)可能位于-990～-204 bp范圍內(nèi)，與Promoter 2.0預測的-801和-501 bp啟動子位置結(jié)論一致；-204～+232 bp區(qū)域內(nèi)可能存在負調(diào)控元件，與該區(qū)域內(nèi)的CpG島(-93～+7 bp)和GC box(-138～-123 bp)有關(guān)，或正調(diào)控元件不能發(fā)揮啟動作用。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 17.0軟件的ANOVA對系列缺失片段活性進行分析，采用LSD多重比較對每個檢測片段的啟動子活性作兩兩比較。對點突變載體利用獨立樣本t檢驗比較突變前后活性變化。P<0.01表示差異極顯著。

由驗證結(jié)果可知，所有的觀測變量與其對應的具體因素之間都具有顯著性關(guān)系。再通過表4可發(fā)現(xiàn)，智慧城市感知質(zhì)量、感知價值以及發(fā)展水平都與智慧城市建設市民滿意度呈顯著正相關(guān)；智慧城市市民抱怨、智慧城市預期與智慧城市建設市民滿意度負相關(guān)是顯著的；智慧城市感知價值、智慧城市發(fā)展水平、智慧城市預期都與智慧城市感知質(zhì)量正相關(guān)是顯著的；智慧城市感知價值、智慧城市發(fā)展水平與智慧城市預期呈正相關(guān)且是顯著的；智慧城市感知價值、智慧城市發(fā)展水平與智慧城市市民抱怨呈負相關(guān)且是顯著的；智慧城市預期與智慧城市市民抱怨呈正相關(guān)但不顯著。在圖2中，用實線代表該影響路徑具有顯著性，用虛線代表該影響路徑不具有顯著性。

以-990～+232 bp的P3片段序列為模板，構(gòu)建系列3′端缺失序列報告基因載體P6～P11，5′端固定在-881 bp位置，3′端依次縮短。如圖1所示，片段P6(-881～+143 bp)包含32 bp元件、M box、CAAT box、GC box、CpG島和5個TATA box；片段P7(-881～-104 bp)在P6基礎上缺少CpG島；P8(-881～-154 bp)在P7基礎上缺少GC box和TATA box；P9(-881～-192 bp)在P8基礎上缺少1個CAAT box和2個TATA box；P10(-881～-232 bp)和P9所包含調(diào)控元件相同；片段P11(-881～-526 bp)只包含32 bp元件。

圖3顯示，片段P6～P10活性值均極顯著高于陰性對照組(P<0.01)，P11活性值與陰性對照差異不顯著(P>0.01)，說明包含預測啟動子位置-801 bp的P11片段僅有32 bp元件并不能啟動DCT基因的表達，必須與其他調(diào)控元件結(jié)合共同發(fā)揮啟動活性。P10片段增加了2個TATA box和1個M box，其啟動活性極顯著高于P11(P<0.01)。這不僅驗證了5′系列缺失片段活性檢測結(jié)果，并進一步精確核心啟動子區(qū)為-881～-232 bp區(qū)，說明包含2個預測啟動子位置-801 和-501 bp的P10，具有32 bp元件(-620～-588 bp)與2個TATA box(-382～-366 bp與-337～-321 bp)和1個M box(-313～-303 bp)組合發(fā)揮了基本轉(zhuǎn)錄活性。

表達載體pGL3-Basic與5′系列缺失片段重組，獲得報告基因載體pGL3-P1～pGL3-P5，瞬時轉(zhuǎn)染A375細胞，細胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染后48 h收獲并裂解細胞，檢測螢火蟲熒光素酶熒光值(F)和海腎熒光素酶熒光值(R)，計算相對熒光素酶活性，即F/R值。結(jié)果顯示(圖3)，P1(-1 827～+232)、P2(-1 366～+232)、P3(-990～+232)和P4(-543～+232)片段活性均極顯著高于陰性對照組(P<0.01)，P3活性極顯著高于其它片段(P< 0.01)，但P5(-204～+232)活性與陰性對照差異不顯著(P>0.01)。

片段P7和P6增加了GC box(-138～-123 bp)、CpG島(-93～+7 bp)和1個TATA box，其活性極顯著低于P8和P9(P<0.01)，說明-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島發(fā)揮了負調(diào)控作用，與5′系列缺失片段發(fā)現(xiàn)的-204～+232 bp的負調(diào)控結(jié)果一致。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變報告基因載體構(gòu)建及活性分析

以P8報告基因載體質(zhì)粒為模板，使用點突變試劑盒構(gòu)建點突變報告基因片段TB1～TB6，PCR產(chǎn)物為環(huán)狀，大小為5 525 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4所示。

課題組設計調(diào)查表，對各地市食藥檢機構(gòu)的人員數(shù)量、編制、職稱、學歷情況進行調(diào)查，于2015年8月5日通過廣西食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)放給8家地市級食品藥品檢驗檢測機構(gòu)填報，2015年9月5日前收回問卷。本次調(diào)查共發(fā)放問卷8份，回收8份，由課題組對數(shù)據(jù)進行核實和匯總。

不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母代表差異不顯著(P>0.01)Columns with different upper case letters mean highly significant difference (P<0.01); Columns with the same upper case letter mean no significant difference (P>0.01)圖3 系列缺失片段熒光素酶相對活性值Fig.3 Luciferase relative activity of serial deleted fragments

TB1～TB6. 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變報告基因片段；M. DNA 相對分子質(zhì)量標準TB1-TB6. Reporter gene fragments with point mutation of transcription factor binding site; M. DNA marker 圖4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變片段擴增結(jié)果Fig.4 Amplification result of point mutation fragments for transcription factor binding sites

圖5顯示，使SOX10結(jié)合位點消失的突變載體TB1(-846和-845 bp)、TB2(-617和-616 bp)和TB3(-604和-603 bp)活性較突變前活性極顯著降低(P<0.01)，推測轉(zhuǎn)錄因子SOX10與DCT基因在核心啟動子區(qū)域的結(jié)合對轉(zhuǎn)錄表達起到正調(diào)控作用。而引起MITF和OTX2結(jié)合位點消失的突變載體TB4(-410 bp)、TB5(-310 bp)和TB6(-277 bp)啟動子活性較突變前極顯著增強(P<0.01)，推測轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄表達起到負調(diào)控的作用或DCT基因存在不依賴于MITF和OTX2的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

3 討 論

3.1 利用山羊DCT基因5′和3′系列缺失片段活性檢測核心啟動子區(qū)

啟動子的檢測方法有多種，最常見的就是報告基因的方法，基本方式就是將生物信息學預測與試驗相結(jié)合，根據(jù)預測結(jié)果有目的地設計試驗，更快地找到核心啟動子區(qū)[21-25]。本試驗在DCT基因序列中發(fā)現(xiàn)了CpG島、TATA box、GC box、CAAT box、M box和32 bp元件，這些都是啟動子附近的標志性元件。而且，通過與GeneCopoeia上公布的人和小鼠DCT基因啟動子序列進行比對，發(fā)現(xiàn)高度相似性序列也覆蓋了這些元件。根據(jù)這些序列特征，再參考在線啟動子預測結(jié)果，首先構(gòu)建了一系列5′端序列缺失報告基因載體，最長片段為2 059 bp。結(jié)果顯示，位于-990～+232 bp位置的片段啟動子活性值最高，不同缺失片段之間啟動子活性都存在極顯著差異，根據(jù)活性變化情況可推測出-990～-204 bp區(qū)域內(nèi)可能存在正調(diào)控元件，在-1 366～-990 bp區(qū)域內(nèi)可能存在負調(diào)控元件。結(jié)合對基因序列特征的分析，發(fā)現(xiàn)片段P4的活性比P3活性顯著降低，在P3片段序列中包含32 bp元件，而P4片段中則沒有，此元件已被證實是DCT基因在色素細胞表達中所必需的[5]，因此可推測，32 bp元件對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。

圖5 點突變報告基因載體與模板P8載體熒光素酶相對活性Fig.5 Luciferase relative activity of mutational and original reporter gene vectors and fragment P8

根據(jù)5′系列啟動子缺失片段活性檢測結(jié)果，在最高活性-990～+232 bp片段的基礎上，構(gòu)建了一系列3′端序列缺失報告基因載體，最長片段為1 024 bp。啟動子活性檢測發(fā)現(xiàn)，-881～-154 bp片段的啟動子活性最高，該序列包括32 bp元件、M box和2個TATA box，推測這些調(diào)控元件組合可維持山羊DCT基因的基本轉(zhuǎn)錄。不同缺失片段啟動子活性之間都存在顯著差異，根據(jù)活性變化情況可推測核心啟動子區(qū)為-881～-232 bp區(qū)，該區(qū)域包含2個預測啟動子位置，具有32 bp元件、2個TATA box和1個M box，這些元件組合發(fā)揮了基本轉(zhuǎn)錄活性。-192～-154 bp間的CAAT box為DCT基因的關(guān)鍵調(diào)控元件，發(fā)揮增強子作用。-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島，對DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負調(diào)控作用。

3.2 利用點突變DCT基因啟動子活性片段檢測轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用

本試驗在前人對不同物種DCT基因的研究基礎上，篩選出了3種與DCT基因轉(zhuǎn)錄表達相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子：SOX10、MITF和OTX2。通過點突變的方法引起轉(zhuǎn)錄因子SOX10結(jié)合位點消失后的3個片段活性均顯著降低，即SOX10能夠激活DCT基因的表達，這與前人研究結(jié)果一致[12-13]。另外，在5′端系列缺失報告基因載體中，片段P3的啟動子活性要顯著高于P4，片段P10的啟動子活性要顯著高于P11，而片段P3和P10序列中都包含了轉(zhuǎn)錄因子SOX10的3處結(jié)合位點，片段P4和P11則沒有SOX10的結(jié)合位點，這一結(jié)果進一步說明了轉(zhuǎn)錄因子SOX10有促進山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄的作用。

而目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子MITF對DCT基因的調(diào)控作用尚存在一些爭議，有研究認為，MITF能夠協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子SOX10刺激并激活DCT基因啟動子的轉(zhuǎn)錄[14-15]，也有研究認為，DCT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控不依賴于MITF，或者MITF對DCT基因發(fā)揮的是負調(diào)控作用[16-18]。本試驗共突變了2處轉(zhuǎn)錄因子MITF的結(jié)合位點，結(jié)果顯示，突變后片段的啟動子活性都顯著增強，但在首輪啟動子缺失片段中，片段P4序列包含了轉(zhuǎn)錄因子MITF的2個結(jié)合位點，而片段P5不包含，但片段P4的活性卻顯著高于片段P5，與MITF結(jié)合位點點突變的結(jié)果相矛盾，因此產(chǎn)生了2種推測結(jié)果：第一，轉(zhuǎn)錄因子MITF抑制DCT基因的表達，但由于片段P4序列中含有其它正調(diào)控元件，而這些正調(diào)控原件發(fā)揮了主要作用；第二，DCT基因可能存在其它不依賴MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。轉(zhuǎn)錄因子OTX2對DCT基因調(diào)控作用的研究目前還不是很多，有研究表明，在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中轉(zhuǎn)錄因子OTX2能夠激活DCT基因的表達，但目前還沒有在黑色素細胞中的研究證明[20]。本試驗通過定點突變改變轉(zhuǎn)錄因子OTX2的結(jié)合位點，結(jié)果顯示，突變后片段啟動子活性顯著上升，說明轉(zhuǎn)錄因子OTX2可能對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負調(diào)控作用。

本研究使用多種實驗動物模型綜合評價注射用雷貝拉唑鈉的藥理學作用。胃潰瘍模型有多種，目前比較常用的大鼠胃潰瘍模型主要有應激性潰瘍（水浸應激模型）、化學因素型胃潰瘍模型（吲哚美辛法、醋酸性）及幽門結(jié)扎型大鼠胃潰瘍模型等，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)也應用到潰瘍模型制備的領域中，如基因敲除技術(shù)、蛋白缺失技術(shù)等［11］。

4 結(jié) 論

本試驗成功構(gòu)建了5個5′端和6個3′端序列缺失啟動子報告基因載體，確定山羊DCT基因啟動子核心區(qū)位于-881～-232 bp區(qū)域；-192～-154 bp區(qū)域內(nèi)可能存在正調(diào)控元件，發(fā)揮增強子作用；-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島對DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子SOX10對山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用，而轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用尚需繼續(xù)深入研究。

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