分子熒光雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法快速測定食品中的鋁

高向陽，楊夢柯

(鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064)

鋁是自然界含量較多的金屬元素[1]，廣泛存在于食品中，在人體內(nèi)能與多種蛋白質(zhì)或酶發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，影響人體正常功能，使大腦骨骼受到損害，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)，甚至造成記憶力和智力下降[2]，進(jìn)而引發(fā)阿爾茨海默癥、帕金森綜合癥、老年癡呆癥[3]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。世界衛(wèi)生組織(WTO)已將鋁確定為食品污染物之一，GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定了面制品中含鋁食品添加劑的用量、殘留量和使用范圍[4]，我國已經(jīng)進(jìn)入老年社會(huì)，因此，建立快速、簡便、準(zhǔn)確測定食品中鋁的新方法對維護(hù)人體健康有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，測定鋁的方法主要有石墨爐原子吸收法[5]、高效液相色譜法[6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[7]、ICP-AES[8]、示波極譜法[9]等，這些方法儀器昂貴、成本高，操作麻煩、分析時(shí)間長，或需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定空白溶液，計(jì)算較為繁瑣復(fù)雜。熒光分析法靈敏度較高、線性范圍廣、選擇性較好、操作簡單快速，已得到實(shí)際應(yīng)用[10]，雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法也稱雙標(biāo)準(zhǔn)比較法或緊密內(nèi)插法[11]，該法利用濃度大(ρ1)、小(ρ2)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將待測試液(ρX)夾在其中，要求ρ1>ρX>ρ2。在相同體積的萃取液中，可簡便的用質(zhì)量代替濃度。在相同條件下，濃度或質(zhì)量與發(fā)光信號(hào)呈正比，依此進(jìn)行定量分析，該法已在環(huán)境監(jiān)測中有所闡述[12]，但雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法在發(fā)光分析領(lǐng)域尤其用分子熒光法測定食品中的鋁至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)8-羥基喹啉與三價(jià)鋁在一定條件下定量形成強(qiáng)熒光配合物的特性，用雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法定量。該法試劑易購、樣品用量少、無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定空白值、快速簡便，為食品中鋁的測定提供了一種全新的分析技術(shù)，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

紫麥和賊小豆：采自鄭州市郊；油條：購自鄭州市早餐攤點(diǎn)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

硝酸、濃氨水：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；氯仿：河南省新鄉(xiāng)市中原有機(jī)化工有限責(zé)任公司；8-羥基喹啉：北京化工廠；冰醋酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公公司。均為分析純。1 000 μg/mL鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液：購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；實(shí)驗(yàn)用水為怡寶純凈水，電導(dǎo)率為2.28 μS/cm。

100 μg/mL鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液配制 準(zhǔn)確移取1 000 μg/mL的鋁標(biāo)品5.00 mL于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液配制 采用逐級稀釋法，將100 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液稀釋為質(zhì)量濃度為10、1、0.2 μg/mL等鋁的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液配制 準(zhǔn)確稱取0.100 0 g的8-羥基喹啉(分析純)于小燒杯中，加入3 mL冰醋酸，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，用水定容。

6 mol/L氨水配制 取45 mL 25%的濃氨水加水稀釋至100 mL。

1.2.2 主要儀器

FW-80型萬能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；pHS-3C型臺(tái)式酸度計(jì)、970CRT型熒光分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SW-TFG12型通風(fēng)柜：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

所有玻璃儀器都要事先用30%硝酸浸泡過夜，用蒸餾水洗凈后方可使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

紫麥、賊小豆分別用研缽研碎，油條剪碎，置于稱量瓶中，在104 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，于干燥器中保存。稱取樣品0.200 0 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)于100 mL錐形瓶中，加入10 mL硝酸-高氯酸(4+1)混合酸，蓋上小漏斗，在通風(fēng)櫥中消解冒白煙近干時(shí)取下，加2 mL水繼續(xù)加熱，待溶液澄清透明取下冷卻后，全部移至25 mL容量瓶中，用水定容、搖勻，此為樣品分析液。

1.3.2 雙標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取1 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液0.10 mL于100 mL燒杯中，加入20 mL水、200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，搖勻，用6 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH 7.60后倒入分液漏斗中，取5 mL氯仿潤洗燒杯后倒入漏斗中萃取，取下層液體于10 mL具塞比色管中，再取5 mL氯仿萃取1次，合并下層萃取液后用氯仿小心定容，搖勻后待測定，此為10 mL氯仿萃取液中含鋁0.10 μg的稀標(biāo)準(zhǔn)溶液；同理，準(zhǔn)確吸取1 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液3.00 mL于100 mL燒杯中，按照以上操作配制10 mL氯仿萃取液中含鋁3 μg的濃標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻待測。

1.3.3 試液制備和測定

準(zhǔn)確吸取樣品分析液1.00 mL于100 mL燒杯中，加入20 mL水、200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，搖勻，以下操作和萃取同1.3.2雙標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器設(shè)定的相同條件下，完成雙標(biāo)準(zhǔn)溶液和試液的測定。按(1)式計(jì)算10 mL樣品氯仿萃取液中鋁的質(zhì)量mx。

(1)

式中，mx為樣品氯仿萃取液中鋁的質(zhì)量，μg；Ix為樣品mx的相對熒光強(qiáng)度；m1、m2分別為濃標(biāo)準(zhǔn)、稀標(biāo)準(zhǔn)氯仿萃取液中鋁的質(zhì)量，μg；I1、I2為濃標(biāo)準(zhǔn)、稀標(biāo)準(zhǔn)氯仿萃取液的相對熒光強(qiáng)度，I1>Ix>I2。

由(1)式可知，(m1-m2)/(I1-I2)為單位熒光發(fā)射強(qiáng)度所相當(dāng)?shù)穆确螺腿∫褐袖X的質(zhì)量。很顯然，在相同條件下測定，此值乘以(IX-I2)即是樣品氯仿萃取液比稀標(biāo)準(zhǔn)氯仿萃取液中多的鋁的質(zhì)量數(shù)值，依據(jù)此比例關(guān)系，可以簡便的實(shí)現(xiàn)快速測定。同時(shí)，按(2)式計(jì)算樣品中鋁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

w/(mg/kg)=mx×25/m

(2)

式中,w為樣品中鋁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；m為稱樣量，g;25為樣品分析液定容的總體積，mL。

1.3.4 樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測定

分別吸取1 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00、0.10、0.40、0.80、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mL于100 mL燒杯中，各加20 mL水和200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，用6 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH 7.60后，倒入分液漏斗中，以下按1.3.2萃取操作。以10 mL氯仿萃取液中Al3+的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，熒光相對強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。由圖1可知，線性回歸方程為y=3.845x+29.908，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。

在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下測定樣品分析液，同時(shí)測定空白，由標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出10 mL氯仿萃取液中Al3+的質(zhì)量。

圖1 8-羥基喹啉鋁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器工作條件

最大激發(fā)波長EX為400 nm；最大發(fā)射波長EM為525 nm；掃描速度為低速；靈敏度為1；EX狹縫為10 nm；EM狹縫為10 nm。

2.2 pH的影響

取12個(gè)100 mL的燒杯，各加人20 mL水，0.2 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液2.00 mL，200 μg/mL 8-羥基喹啉5.00 mL，用6 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH分別調(diào)為4.00、5.00、6.00、7.00、7.30、7.60、7.90、8.00、8.20、8.50、8.80、9.00，分別倒入分液漏斗中，取5 mL氯仿潤洗錐形瓶，以下按1.3進(jìn)行操作、測定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，pH為7.60時(shí)熒光相對值最大且基本穩(wěn)定，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]結(jié)論一致。

圖2 pH對鋁—8-羥基喹啉絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的影響

2.3 最大波長選擇

吸取0.2 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00 mL，置于含有20 mL水的錐形瓶中，再加入5 mL 8-羥基喹啉溶液，調(diào)節(jié)pH為7.60，用10 mL氯仿萃取，以下操作同1.3.2。固定EM發(fā)射波長510 nm[12]，設(shè)置EX為250～800 nm，在2.1其他條件下掃描，由圖3可知，最大激發(fā)波長為400 nm；固定EX激發(fā)波長為400 nm，設(shè)置EM為250～800 nm掃描，由圖4可知最大發(fā)射熒光波長為525 nm。最大波長各文獻(xiàn)報(bào)道的均略有差異[10,13-14]，本實(shí)驗(yàn)亦是如此，可能與儀器誤差有關(guān)。

圖3 鋁—8-羥基喹啉絡(luò)合物的激發(fā)光譜

圖4 鋁—8-羥基喹啉絡(luò)合物的熒光發(fā)射光譜

2.4 萃取次數(shù)對熒光強(qiáng)度的影響

取5個(gè)100 mL燒杯，分別加20 mL水、0.2 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液2.00 mL，8-羥基喹啉5.00 mL，用氨水調(diào)節(jié)pH 7.60后，1號(hào)溶液用10 mL氯仿萃取1次，2號(hào)溶液用10 mL氯仿分2次萃取，依次類推，每次萃取操作與步驟1.3.2相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。由圖可知，10 mL氯仿萃取2次后測定的相對熒光值最大，效果最為理想。

圖5 萃取次數(shù)對鋁—8-羥基喹啉絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的影響

2.5 絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間的影響

向7個(gè)燒杯中各加20 mL水，0.2 μg/mL的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液2.00 mL，200 μg/mL 8-羥基喹啉5.00 mL，用6 mol/L氨水調(diào)節(jié)pH 7.60后,馬上計(jì)時(shí)，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間分別為0.0、5.0、10、20、30、40、50 min，按1.3操作萃取后測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響

由圖6可知，絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間對測定影響不大。

2.6 測定結(jié)果及精密度

按實(shí)驗(yàn)方法，在儀器工作條件下，用雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法對照測定，各樣品分別進(jìn)行5次平行測定，檢驗(yàn)無可疑值后報(bào)告，測定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)偏差S、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見表1。

表1 測定結(jié)果及精密度(n=5)

測定結(jié)果表明，油條鋁含量最高，其次是紫麥和賊小豆。按照文獻(xiàn)[15]對2種方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，通過F檢驗(yàn)和t可知，2種分析方法不存在顯著的偶然誤差和系統(tǒng)誤差，結(jié)論的置信度為95%。

2.7 檢出限與定量限

對0.1 μg/mL鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用實(shí)驗(yàn)方法和儀器條件進(jìn)行11次平行測定，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算的檢出限0.030 μg/mL，按10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算的定量限為0.10 μg/mL。

2.8 加標(biāo)回收率

以紫麥和賊小豆為樣品，分別加入0.50、2.00、10.00 μg的鋁標(biāo)準(zhǔn)使用液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，在儀器工作條件下進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果

由表2可知，雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法的回收率在96.0%～107.2%之間。

3 結(jié)論

用雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法定量測定食品中的鋁，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，避免了作圖誤差和時(shí)常校正標(biāo)準(zhǔn)曲線所帶來的諸多不便。由計(jì)算公式(1)可知，所用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度處于試液的濃度左右，本法在完全相同的條件下，測定的是熒光信號(hào)差值所相當(dāng)?shù)臐舛炔钪担?-羥基喹啉空白微弱的熒光信號(hào)在測定中已經(jīng)予以扣除，無需再重復(fù)測定空白。該法簡便、快速，結(jié)果計(jì)算簡單，精密度和回收率較為理想。在儀器工作條件下，方法測得的檢出限為0.030 μg/mL，定量限為0.10 μg/mL，回收率在96.0%～107.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<1%。與工作曲線法對照測定樣品，經(jīng)F和t檢驗(yàn)表明，2種方法間的測定結(jié)果不存在顯著性差異，結(jié)論的置信度為95%，為食品中鋁的快速測定提供了科學(xué)參考。

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