豬致病性大腸桿菌的分離及中藥藥敏試驗

徐東方，韓 露

（1.河南省獲嘉縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)動物防疫檢疫中心站，河南 獲嘉 453800；2.河南省畜牧總站）

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的多種動物和人的一組腸道性共患傳染病，是目前養(yǎng)豬業(yè)最常見和危害性最大的細(xì)菌性疾病之一。它結(jié)構(gòu)比較簡單，容易培養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，被公認(rèn)為生物學(xué)上重要的實驗材料。由于該病對仔豬危害較大，因此找出最有效的防治方法特別重要，豬大腸桿菌病的傳統(tǒng)治療多用抗生素，但是由于用藥的不規(guī)范從而導(dǎo)致部分大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性。中藥治療該疾病愈來愈受到重視，所以該文對豬致病性大腸桿菌的分離及中藥藥敏進(jìn)行了試驗，試驗結(jié)果表明，中藥治療及預(yù)防仔豬大腸桿菌病具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基及實驗儀器

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；無菌操作臺，立式高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱。

1.1.2 試劑及實驗動物

大腸桿菌因子，生化試劑以及其他相關(guān)用品均購自上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠；實驗所需小白鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗中心提供。

1.1.3 病料

來自河南省輝縣、獲嘉縣等地的大中型豬場中具有很明顯腹瀉癥狀的或者具有黃白痢癥狀的仔豬，用直腸棉拭子蘸取少量的排泄物混懸于裝有1ml營養(yǎng)肉湯的試管中。

1.1.4 受試中藥

大黃、甘草、黃連、胡黃連、元胡、黃薄荷、當(dāng)歸、杏仁、首烏、獨活、澤瀉、蒼術(shù)、丹參、麻黃、梔子、柴胡、枳實等31種中藥。

1.1.5 生化試劑

蔗糖、山梨醇、硫化氫、V-P試劑、尿素、MR試劑、蛋白胨水、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、糖類發(fā)酵管等均按常規(guī)方法制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 病豬剖檢及病料采集

對病豬進(jìn)行剖檢：患病的仔豬具有急性卡他性腸炎癥狀，腸道腫脹，胃內(nèi)有凝乳塊，腸系膜淋巴結(jié)水腫，充血，有彌漫性針尖狀出血。剖開可見腸道內(nèi)充滿黃綠色液體內(nèi)容物和氣泡或充滿灰白色醬糊狀內(nèi)容物和氣泡，散發(fā)腥臭味。個別病豬肝臟、腎臟出現(xiàn)小的壞死灶。無菌條件下用直腸棉拭子蘸取少量的病豬的排泄物混懸于盛有10 ml普通營養(yǎng)肉湯的試管中，備用。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)與純化

將采集的病料涂片，革蘭氏染色，鏡檢。同時無菌操作將可疑病料接種在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長及菌落特征。以無菌操作挑單個典型菌落的一半劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基與麥康凱培養(yǎng)基上37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，將另一半菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢;細(xì)菌的純化：取初步分離的細(xì)菌，在普通培養(yǎng)基上畫線接種后，在37℃下恒溫培養(yǎng)一天，獲得的純培養(yǎng)物放在4℃的低溫環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化試驗鑒定

用滅菌環(huán)挑取麥康凱瓊脂平板上的形態(tài)特征明顯的紅色單菌落，做細(xì)菌的微量生化實驗。

1.2.4 致病性試驗

將分離純化后的大腸桿菌，接種于普通肉湯培養(yǎng)物中，搖床37℃培養(yǎng)24 h作為致病性試驗菌液。①注射菌數(shù)：每只小白鼠注射0.5 ml。②注射方法：取各種生理標(biāo)準(zhǔn)相似的健康小白鼠15只，分別進(jìn)行腹腔注射，24 h以后觀察發(fā)病情況，剖開觀察病變后進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.5 細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

在無菌工作臺中用滅菌的接種環(huán)挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上單個的粉紅色菌落接種于多個普通瓊脂培養(yǎng)基上，涂滿整個平皿，然后恒溫培養(yǎng)24 h。劃線培養(yǎng)，須涂滿整個平板，隨后進(jìn)行藥敏試驗。

1.2.6 中藥的煎制

將黃芩、黃連等31種中藥分別按照20 g：200 ml的比例煎藥，每份中藥重20 g，用涼水煎，在水沸前加入藥物，先用大火煮煎到水沸，水沸后再用小火繼續(xù)煎45 min。煎制好的藥液要求每毫升含藥物量為1 g，取煎好的藥液用四層紗布過濾裝入滅菌的玻璃瓶（20 ml）中，瓶口壓線，再次高壓蒸汽滅菌，晾涼后備用。

1.2.7 中藥藥敏片的制備

用打孔器將濾紙片制成小圓片（直徑約6 mm），用報紙包好，高壓蒸汽鍋121℃消毒0.5 h。將滅菌濾紙片放入事先準(zhǔn)備好的中藥藥液中浸泡45 min，備用。

1.2.8 中藥藥敏試驗方法

將制好的藥敏片無菌貼在涂滿細(xì)菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面上，每個平皿上按照標(biāo)準(zhǔn)放入四片，紙片間的距離要適當(dāng)，方便觀察。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.9 藥敏試驗結(jié)果判定

對藥的敏感性通過抑菌圈的大小來判斷。根據(jù)參考文獻(xiàn)上的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大表明該藥的敏感性越高。凡是抑菌圈直徑≥10 mm者為強(qiáng)抑菌（敏感），用+++表示；抑菌圈直徑為8～9 mm者為抑菌（中敏），用++表示；抑菌圈直徑≤6 mm者為弱抑菌（耐藥）。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌落與細(xì)菌形態(tài)

在麥康凱瓊脂平板上形成了邊緣整齊、直徑2～3 nm中央凹陷、中等大小的粉紅色菌落；伊紅美藍(lán)瓊脂平板上形成深紫色、隆凸、表面濕潤、有黑色金屬光澤，直徑約1.5～2.5 nm的菌落。普通培養(yǎng)基中光滑、濕潤、半透明、外觀呈圓形有凸起、顏色灰白的菌落。

2.2 生化試驗鑒定結(jié)果與分析

細(xì)菌生化試驗結(jié)果可得所培養(yǎng)的細(xì)菌生化實驗?zāi)馨l(fā)酵乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，多數(shù)不發(fā)酵蔗糖或者少數(shù)延遲發(fā)酵蔗糖、三糖鐵底部產(chǎn)酸、MR試驗陽性、VP試驗陰性、產(chǎn)生靛基質(zhì)、尿素酶試驗陰性，實驗結(jié)果顯示的特征符合大腸桿菌的特點。

2.3 致病性實驗結(jié)果與分析

將分離純化培養(yǎng)的細(xì)菌，接種到試驗用小白鼠體內(nèi)，對24 h后出現(xiàn)病理癥狀的小白鼠進(jìn)行剖檢，分離病料采集細(xì)菌?？傻弥?xì)菌染色形態(tài)，生化特征，以及病理變化與接種菌一致，說明接種的大腸桿菌具有致病性。

2.4 藥敏試驗結(jié)果與分析

通過藥敏試驗得出，大腸桿菌對薄荷、朱砂、黃連、防風(fēng)、地榆、王不留敏感；對杏仁、首烏、獨活、石膏、梔子、柴胡、枳實、丹參、麻黃、大黃等中度敏感；對甘草、黃精、連翹、牛膝、胡黃連、元胡、黃黨參、萊菔子、黃芩有一定的耐藥性。

3 討論

從上面的實驗結(jié)果，可以找到幾種對仔豬大腸桿菌具有特效的中藥。下面對這幾種高效藥物的作用，進(jìn)行詳細(xì)的表述：①黃連：清熱燥濕，瀉火解毒。黃連內(nèi)含小蘗堿，它具有廣譜抗菌性，對多種桿菌、球菌、真菌、病毒等都有較強(qiáng)的抑制作用。特別是對菌痢、腹瀉、胃腸炎等癥效果極好。小蘗堿具有良好的消炎、利膽、擴(kuò)張血管和降低血壓的作用，并且還能增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。用于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、胃腸濕熱、瀉痢等癥，和木香、黃芩等一起合用以治瀉痢。②朱砂：朱砂可以安神，明目，解毒。主要成分為硫化汞，但常夾雜雄黃，瀝青質(zhì)等有解毒防腐作用。外用能抑制或殺滅皮膚細(xì)菌和寄生蟲。清熱解毒效果好，內(nèi)服、外用均可。③薄荷：俗名“銀丹草”，是中國常用中藥之一。它的活性成分為薄荷油。薄荷油中主要成分為I-薄荷醇、1-薄荷酮及薄荷酯類等。薄荷油是一種常用的藥物。它不僅能促進(jìn)呼吸道腺體分泌，而且對呼吸道炎癥有治療作用。試驗研究表明，薄荷煎劑對單純性皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒有抑制作用，而且對腸炎球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌等有很好的抑菌作用。

中草藥在防治大腸桿菌病方面的特點和優(yōu)勢與化學(xué)藥物和抗生素相比表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢?；瘜W(xué)藥物和抗生素耐藥譜廣，具有毒副作用，甚至能通過肉、蛋傳給人類，中草藥克服了這一難題。可見中草藥可以為人類健康帶來很大的保障。

4 小結(jié)

通過對疑似患有大腸桿菌病的仔豬進(jìn)行臨床觀察，剖檢，并進(jìn)行實驗室檢查，確定患病仔豬患有大腸桿菌病，并從病料中分離到致病性大腸桿菌，對分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗，試驗結(jié)果表明，黃連對大腸桿菌具有良好的抑菌效果，因此選用黃連作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。由于抗生素在治療和預(yù)防用藥中容易產(chǎn)生耐藥性，而中藥可以避免機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，因此選用中藥治療及預(yù)防仔豬大腸桿菌病具有重要意義?！?/p>