豬細(xì)小病毒檢測(cè)方法的研究綜述

劉勝利 ，呂玉金 ，李文剛 ＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

豬細(xì)小病毒?。≒PI）是由豬細(xì)小病毒引起的母豬繁殖障礙病，主要特征為母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及不育、早期胚胎死亡和新生仔豬大量死亡等，也可引起仔豬腹瀉、皮炎及關(guān)節(jié)炎等。此病發(fā)生時(shí)，病變主要體現(xiàn)在胎兒，常見(jiàn)的有：胎兒水腫、充血、出血、體腔積液、脫水（木乃伊化）及壞死等病變，而母豬則無(wú)明顯臨床癥狀。

隨著行業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模化、密集型程度越來(lái)越高，豬群的跨區(qū)域流通機(jī)會(huì)也越來(lái)越多，加快了豬細(xì)小病毒病的傳播，且出現(xiàn)了多病混合感染的現(xiàn)象。從1966年首次發(fā)現(xiàn)該病分離出病毒后，到目前為止，世界各國(guó)均有流行和報(bào)道，?，F(xiàn)多種病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)外有多種檢測(cè)方式，如血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。其中血清學(xué)檢測(cè)較為常用，但分子生物學(xué)檢測(cè)更為準(zhǔn)確、快速，并可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。

1 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法

豬細(xì)小病毒病可根據(jù)其流行病學(xué)、臨床癥狀以及剖檢癥狀，做出初步診斷，但確診仍需借助病毒分離、鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷方法。此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且還需要特定的設(shè)備和技術(shù)。

在進(jìn)行病毒的分離與鑒定時(shí)，取疑似感染豬細(xì)小病毒（PPV）的病料，將病料加雙抗研磨成乳濁液，離心后取上清液，接種于PK-15細(xì)胞或ST細(xì)胞分離培養(yǎng)。接毒2～3 d后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，收獲病毒，電鏡觀察。此方法直接、準(zhǔn)確、有效，但耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足傳染病疫情防治工作的需要，不利于基層單位的使用。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)

HA和HI試驗(yàn)是最簡(jiǎn)單、最常用的檢測(cè)豬細(xì)小病毒的血清學(xué)檢測(cè)方法。PPV能凝集人、猴、貓、雞、豚鼠、大鼠和小鼠的紅細(xì)胞，一般實(shí)驗(yàn)室常用豚鼠紅細(xì)胞作為凝集細(xì)胞。該方法簡(jiǎn)單方便、易行，且能進(jìn)行快速、大量的樣品檢測(cè)，因此應(yīng)用普遍。HI試驗(yàn)是檢測(cè)抗體的最常用的方法:將待檢血清滅活處理后，用紅細(xì)胞吸附，除去血清中的非特異性血凝素，用高嶺土吸附來(lái)除去或減少非抗體性抑制因子。該方法較簡(jiǎn)便、靈敏度也較高；但所需紅細(xì)胞需現(xiàn)用現(xiàn)配，被檢血清的處理也較為繁瑣。

2.2 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)也是常用的檢測(cè)PPV抗體的方法。其用PPV與被檢血清的抗體進(jìn)行中和，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的病變狀況來(lái)計(jì)算血清抗體的滴度。中和試驗(yàn)的特異性較高，但操作較復(fù)雜，完成一次試驗(yàn)常需一周或更長(zhǎng)的時(shí)間，不適于臨床診斷，并且該方法需要水準(zhǔn)較高的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和病變結(jié)果判定技術(shù)等專(zhuān)業(yè)技術(shù)，一般實(shí)驗(yàn)室不采用。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是一種將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的用于檢測(cè)的應(yīng)用型技術(shù)，既可用于檢測(cè)抗原，又可用于檢測(cè)抗體。Hohdalsu等建立了豬細(xì)小病毒的ELISA診斷技術(shù)，敏感性顯著高于HI的檢測(cè)結(jié)果。ELISA檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)和敏感度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層獸醫(yī)部門(mén)及大面積疫病普查。田莉莉等建立了檢測(cè)豬細(xì)小病毒的抗原捕捉ELISA方法（AC-ELISA）用來(lái)制備豬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體（McAb）。該方法與RT-PCR相比較，符合率較高，有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可應(yīng)用于豬細(xì)小病毒感染的早期診斷。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 PCR檢測(cè)技術(shù)

PCR技術(shù)是1985年的美國(guó)一公司人類(lèi)遺傳研究室發(fā)明的體外擴(kuò)增特異DNA片段的一種技術(shù)。PCR檢測(cè)方法是將PCR技術(shù)與電泳技術(shù)相結(jié)合，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、易操作、耗時(shí)短，已成為臨床檢測(cè)PPV的首選方法（但存在假陽(yáng)性和PCR污染等弊端）。Moliter等最先報(bào)道了PCR在檢測(cè)PPV上的應(yīng)用。

3.2 多重PCR診斷檢測(cè)技術(shù)

多重PCR診斷方法是普通PCR的改良版，是將多對(duì)特異性引物加入同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR診斷技術(shù)。因?yàn)槎嘀豍CR能夠在一個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，因此，既有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)，又能節(jié)約大量的時(shí)間、人力和物力等，它能快速、準(zhǔn)確地診斷疾病，適用于大量臨床樣品（特別是混合感染樣品）中病原體的快速診斷。Huang C等建立了多重PCR技術(shù)用于PRV、PPV和PCV的診斷，該法能同時(shí)檢測(cè)3種病毒的感染。在國(guó)內(nèi)，李文剛、王漢中分別據(jù)VP1、VP2序列設(shè)計(jì)了nest-PCR引物，提高了檢測(cè)的特異性和敏感性。

3.3 Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)方法

隨著熒光定量PCR儀的普及，熒光定量PCR技術(shù)飛速發(fā)展，它將常規(guī)PCR技術(shù)與熒光檢測(cè)相結(jié)合，用來(lái)檢測(cè)臨床病料中的各種病原。與普通PCR方法相比，熒光定量PCR特異性強(qiáng)、靈敏性高、用時(shí)短，而且有相應(yīng)的分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、整理，結(jié)果更為準(zhǔn)確、直觀。另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只需打開(kāi)1次試管，有效地減少了假陽(yáng)性的發(fā)生機(jī)會(huì)，已成為檢測(cè)病原體的重要方法。探針?lè)晒釶CR增加了探針結(jié)合的反應(yīng)，進(jìn)一步提高了其特異性。

3.4 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法

SYBR GreenⅠ是一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，與PCR合成的雙鏈DNA結(jié)合后，在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR的產(chǎn)物量。SYBR GreenⅠ嵌合熒光簡(jiǎn)單，成本較低，并且反應(yīng)后無(wú)需電泳檢測(cè)，污染率低、反應(yīng)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，且不需要探針，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，成本較低，能滿足診斷的要求。但熒光染料能和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。

3.5 LAMP檢測(cè)方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種可高效擴(kuò)增核酸并廣泛應(yīng)用于疫病快速檢測(cè)的一種新型檢測(cè)方法。日本學(xué)者Notomi等發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，其針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)了2～3對(duì)特異引物（內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，其中環(huán)引物為非必要引物），在Bst DNA poLymerase等溫條件下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件低、反應(yīng)成本低和設(shè)備要求低等優(yōu)勢(shì)，適合用于臨床PPV快速檢測(cè)。

3.6 基因芯片檢測(cè)技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來(lái)新興起的一種基因診斷技術(shù)，其原理是在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接將探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，再檢測(cè)分析雜交信號(hào)，最終得到樣品的預(yù)定結(jié)果，基因芯片技術(shù)流程中尤以樣品的固定和雜交的檢測(cè)最為重要。該技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多種病毒，同步檢測(cè)多個(gè)樣品，其具有特異、敏感、快速、高效、可重復(fù)、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，節(jié)約了疾病診斷時(shí)間，因而具有良好的實(shí)用性。1995年Schena發(fā)表了第一篇關(guān)于基因表達(dá)芯片的論文，從此以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

3.7 可視化基因芯片檢測(cè)

可視化芯片技術(shù)是在常規(guī)芯片基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)類(lèi)型，其在基因芯片技術(shù)基礎(chǔ)上，將待檢病原體的特異片段作為探針固定在芯片上，用標(biāo)記有生物素的靶基因與之雜交，再加入納米金標(biāo)記的鏈霉親和素，最后用硝酸銀和對(duì)苯二酚混合液進(jìn)行銀染從而可以用肉眼或是簡(jiǎn)單的光學(xué)成像系統(tǒng)捕獲信號(hào)。可視化生物芯片具有快速、可視、設(shè)備要求低等特點(diǎn)，近些年來(lái)被廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)、基因突變檢測(cè)及差異表達(dá)、酶功能研究等方面，具有巨大的潛在應(yīng)用前景。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，豬細(xì)小病毒的診斷方法很多，應(yīng)用最多的是血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其是血凝和血凝抑制試驗(yàn)，但前者實(shí)驗(yàn)特異性、敏感度較低，在低滴度感染時(shí)難于檢出，后者配置血清較麻煩。分子生物學(xué)診斷技術(shù)中，最常用的是普通PCR技術(shù)，但無(wú)法一次性檢測(cè)多個(gè)樣品，而多重PCR檢測(cè)，熒光定量檢測(cè)，LAMP檢測(cè)，基因芯片等方法則具有高度的特異性、靈敏性，可檢測(cè)大量樣品，適應(yīng)于多種病毒混合感染，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、快速，尤其是基因芯片技術(shù)具有高并行性、高通量的特點(diǎn)，可進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)，但是，其所需的設(shè)備體積較大、價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高，普通實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展相關(guān)工作?？梢暬蛐酒腔蛐酒夹g(shù)的未來(lái)走向，它不需昂貴的熒光掃描設(shè)備，降低了成本，不受環(huán)境局限等，增加了生物芯片的使用范圍，在臨床應(yīng)用方面將具有更好的發(fā)展前景，但目前做不到具備高質(zhì)量和低價(jià)格的可視化基因芯片，因此無(wú)法推廣，需打好基礎(chǔ)，做出高質(zhì)量的基因芯片。以上是各種檢測(cè)方法的比較，各有優(yōu)劣，可根據(jù)自身情況優(yōu)化選擇最適合的檢測(cè)方法?！?/p>