朱頂紅中化學(xué)成分提取分離及其結(jié)構(gòu)鑒定

薛沁冰， 李 鑫， 辛國松， 魏 馳， 朱洪劍， 厲曾毅， 趙 賀， 季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076; 2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076 )

朱頂紅(Hippeastrumvittatum)原產(chǎn)于中南美洲巴西和秘魯，原產(chǎn)秘魯安第斯山脈的朱頂紅于1789年傳入歐洲，現(xiàn)在世界各地廣泛種植的孤挺花原產(chǎn)南非于好望角并于1633年傳入歐洲[1].19世紀(jì)中期至20世紀(jì)，超過50個(gè)朱頂紅屬野生品種被引種至歐洲[2].朱頂紅于20世紀(jì)初引入中國，約有75個(gè)種，現(xiàn)有許多種間雜交新種，主要露地栽培于長江中下游以南地區(qū)均可露地栽培，其他地區(qū)多盆栽觀賞[3].近年來國內(nèi)外學(xué)者對朱頂紅進(jìn)行了廣泛的研究，研究這種植物的鱗莖、根及鮮花的提取物已分離出多種化學(xué)成分[4].近年來，通過對朱頂紅的深入研究發(fā)現(xiàn)，朱頂紅還具有抗腫瘤，抗病毒，抗炎等藥理活性.惡性腫瘤己成為威脅人類健康和導(dǎo)致死亡的主要因素之一[5-12].自然界中許多生物堿類都具有抗腫瘤活性，石蒜科生物堿的抗腫瘤活性也十分引人注目.人們對石蒜屬的植物進(jìn)行了廣泛的生理活性研究有研究表明石蒜科植物中化學(xué)成分具有一定的抗腫瘤、抗癌活性[13].石蒜堿作為朱頂紅中重要的提取成分，其對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性[14-22].石蒜堿對小鼠纖維肉瘤Meth-A有很強(qiáng)的抑制作用(ED50=0.3 μg/mL)，對小鼠皮下植入 Lewis 肺癌的抑制率為80.5%[23].Liu[24-25]等研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿對多種腫瘤細(xì)胞株，如人早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U373)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)、轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞(C8161)等均顯示良好的抗腫瘤活性，且作用機(jī)制與其抗增殖、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用有關(guān).石蒜堿的凋亡誘導(dǎo)作用主要是通過觸發(fā)線粒體凋亡途徑來發(fā)揮作用.Goietseno-ven等[26-27]對石蒜堿型生物堿的構(gòu)效關(guān)系研究表明：其抗增殖活性的主要結(jié)構(gòu)是未經(jīng)修飾的C環(huán)、連接的 C/D 環(huán)，而不是二氧甲叉基環(huán).最新研究表明，石蒜堿還可以通過上調(diào)p21基因表達(dá)，抑制HL-60細(xì)胞增殖[28].

1 儀器與材料

EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥DHG-9140A(上海一恒科技有限公司)真空干燥箱DZF-6030A(上海一恒科技儀器有限公司)KQ2200DE型超聲機(jī)(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)CO-150型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NBS公司)DL-CJ-IND型醫(yī)用潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)CKS-41-32 型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)植物朱頂紅新鮮葉片.

2 提取與分離

2.1 化學(xué)成分的提取

朱頂紅新鮮葉片切片陰干，粉碎，過20～30目篩，備用.稱取朱頂紅干燥葉片3 kg，置于圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶劑，料液比為1∶12，在90℃溫度下，加熱回流提取3次，每次提取3 h，合并提取液.經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去試劑，濃縮的到總浸膏，粗提物加少量水至懸浮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，分別合并萃取液，濃縮回收試劑得石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部分17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.

2.2 朱頂紅正丁醇部分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

將朱頂紅二氯甲烷部分提取物通過薄層色譜板分離的條件作為基礎(chǔ)，然后根據(jù)初步摸索到的條件將藥品上樣到硅膠柱上，反復(fù)進(jìn)行淋洗，保留有意義組分，再經(jīng)ODS反相柱進(jìn)行分離純化，得到的樣品經(jīng)過高效液相分析其峰的情況，若該樣品峰型達(dá)到基線分離并且足量，則將該樣品進(jìn)行高效液相制備，制備出峰型較好的該單體化合物.

2.3 MTT法檢測朱頂紅四部分提取物對人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖作用的影響

從37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中取出處于對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，在無菌操作臺內(nèi)倒掉該細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的原有培養(yǎng)液，用3 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，十字花形洗滌3次，動(dòng)作要輕柔，洗滌后倒掉，加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將瓶蓋旋緊后放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞彼此脫落，從不規(guī)則的貼壁狀變小變圓時(shí)即消化完全，迅速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，倒掉胰酶，加入3 mL含有12%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用滅菌的膠頭滴管反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁細(xì)胞，直至吹落瓶壁上的細(xì)胞，動(dòng)作要輕柔，吹打要均勻.利用計(jì)數(shù)板將吹勻的細(xì)胞懸液質(zhì)量濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液于滅菌后的96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，邊緣孔加入100 μL PBS，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞24 h后，取出96孔板，用完全培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度的待測的朱頂紅提取物(石油醚部分、二氯甲烷部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分)，使給藥質(zhì)量濃度分別為160、80、40、20、10 μg/mL，以每孔100 μL分別加入到96孔板中.每個(gè)劑量設(shè)6組平行的復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性.空白對照組不加入藥物，但是加入100 μL RPMI1640培養(yǎng)液.之后將該96孔板放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

藥物作用72 h后吸去孔中液體，之后每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)液體，每孔再避光加入150 μL DMSO溶液，采用微量震蕩儀振蕩5 min，用酶標(biāo)儀測定吸光度值OD，參考波長為490 nm，檢測波長為570 nm.觀察給藥組細(xì)胞的相對活力.

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通過加熱回流法對3 kg的朱頂紅干燥葉片進(jìn)行提取，分別得到石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.選取正丁醇層，通過硅膠柱層析、ODS柱層析，對其進(jìn)行分離純化.

硅膠吸附色譜法中采用二氯甲烷-甲醇洗脫體系，比例依次為100∶0、100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，最后選用0∶100進(jìn)行沖柱，總共收集到376個(gè)餾分，經(jīng)TLC檢測相同Rf值得合瓶后得到12個(gè)餾分.從12個(gè)餾分選取三個(gè)分離度較好且樣品量較大的樣品采用ODS色譜法對所得樣品進(jìn)行再次純化，用薄層層析檢測合瓶后，從樣品A1(1.04 g)中分離得到5個(gè)樣品為樣品A1-1(138.4 mg)，樣品A1-2(102.3 mg)，樣品A1-3(170.3 mg)，樣品A1-4(245.8 mg)，樣品A1-5(96.2 mg).從樣品A2(0.84 g)中分離得到5個(gè)樣品為樣品A2-1(127.6 mg)，樣品A2-2(100.3 mg)，樣品A2-3(100.9 mg)，樣品A2-4(94.4 mg)，樣品A2-5(82.3 mg).從樣品A3(0.93 g)中分離得到5個(gè)樣品為樣品A3-1(93.0 mg)，樣品A3-2(82.1 mg)，樣品A3-3(101.6 mg)，樣品A3-4(77.4 mg)，樣品A3-5(62.0 mg).經(jīng)ODS色譜柱分離純化共得到15個(gè)樣品.

經(jīng)ODS分離后得到的樣品經(jīng)過分析型高效液相色譜儀，流動(dòng)相為甲醇-水，根據(jù)樣品極性大小，選擇合適的流動(dòng)相比例，直至樣品中的色譜峰達(dá)到基線分離，并且峰型較好方可利用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行單體化合物的制備.經(jīng)HPLC分析后，對峰型較好的化合物進(jìn)行單體制備，選取樣品A1-4、樣品A2-2進(jìn)行制備，制備得到4個(gè)化合物，化合物1(10.6 mg)、化合物2(9.3 mg)、化合物3(4.9 mg)，化合物4(6.6 mg).

對上述4個(gè)化合物進(jìn)行純度判定，經(jīng)HPLC中檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)組分為單一色譜峰圖，為單一化合物.其他組分為單一峰但是峰型不好或有雜峰，顯然不是單體化合物，且樣品純度不足80%，不能視為單體化合物，需繼續(xù)分離純化而分離出單體化合物.所得單體化合物為化合物1(10.6 mg)、化合物2(9.3 mg).

1)化合物1：淡黃色塊晶(CH3OH).甲醇溶解后，毛細(xì)管蘸取少量，于活化后的硅膠GF-254薄層板上點(diǎn)樣，晾干后，放入氨水飽和的展開缸中展開，展開劑比例為二氯甲烷∶甲醇=20∶1，在254 nm紫外燈下進(jìn)行檢測，該斑點(diǎn)顯示為藍(lán)紫色暗斑.采用三相系統(tǒng)對其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)純，展開劑分別為石油醚∶丙酮(1∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)、二氯甲烷∶甲醇(25∶1)，發(fā)現(xiàn)其均為單一斑點(diǎn)，證明此化合物的確為單體化合物.

2)化合物2：淡黃色塊晶(CH3OH).甲醇溶解后，毛細(xì)管蘸取少量，于活化后的硅膠GF-254薄層板上點(diǎn)樣，晾干后，放入氨水飽和的展開缸中展開，展開劑比例為二氯甲烷∶甲醇=9∶2，在254 nm紫外燈下進(jìn)行檢測，該斑點(diǎn)顯示為藍(lán)紫色暗斑.采用三相系統(tǒng)對其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)純，展開劑分別為石油醚∶丙酮(1∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)、二氯甲烷∶甲醇(25∶1)，發(fā)現(xiàn)其均為單一斑點(diǎn)，證明此化合物的確為單體化合物.

4結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)理化性質(zhì)，光譜學(xué)分析和文獻(xiàn)對照等多種方法鑒定出兩個(gè)化合物的平面結(jié)構(gòu).結(jié)果如下.

在13C-APT (CD3OD, 150 MHz)譜中，δC: 157.6 (C-9), 157.1 (C-7), 148.6 (C-4′), 147.5 (C-3′)是苯環(huán)上連O碳信號，136.4 (C-1′), 131.0 (C-5)是苯環(huán)上季碳信號，118.6 (C-6′), 114.4 (C-10), 114.3 (C-5′), 112.7 (C-2′), 109.1 (C-6), 104.1 (C-8)是2個(gè)ABX系統(tǒng)上苯環(huán)C信號，78.7 (C-2)為C環(huán)上連O碳信號，56.9 (4′-OCH3)為甲氧基信號，31.6 (C-4), 25.6 (C-3)為C環(huán)上仲碳信號.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]上報(bào)道的一致， 鑒定該化合物為(2S)-7,3'-二羥基-4'-甲氧基黃烷((2S)-7,3'-dihydroxy-4'-methoxy-flavan)，分子式為C16H16O4，分子質(zhì)量為272.30.結(jié)構(gòu)式見圖1，13C-NMR見圖2，1H-NMR見圖3.

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)圖

圖2 化合物1的碳譜圖

在13C-APT (CD3OD, 150 MHz)譜中，δC: 157.8 (C-9), 157.3 (C-7), 150.6 (C-4′), 150.2 (C-3′)是苯環(huán)上連O碳信號，136.5 (C-1′), 131.2 (C-5)是苯環(huán)上季碳信號，119.9 (C-6′), 114.5 (C-10), 113.0 (C-5′), 111.3 (C-2′), 109.4 (C-6), 104.2(C-8)是2個(gè)ABX系統(tǒng)上苯環(huán)C信號，79.0 (C-2)為C環(huán)上連O碳信號，56.9和56.6為兩個(gè)甲氧基信號，31.6 (C-4), 25.6 (C-3)為C環(huán)上仲碳信號.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]上報(bào)道的一致，鑒定該化合物為(2S)-7-羥基-3',4'-二甲氧基黃烷((2S)-7-hydroxy-3'',4'-dimethoxy-flavan).分子式為C17H18O4，分子質(zhì)量為286.12，結(jié)構(gòu)式圖見圖4，13C-NMR見圖5，1H-NMR見圖6.

圖3 化合物1的氫譜圖

圖4 化合物2結(jié)構(gòu)圖

圖5 化合物2 的碳譜圖

圖6 化合物2的氫譜圖

5 結(jié) 語

本文通過回流法對3kg的朱頂紅干燥葉片進(jìn)行提取，得石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部分17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.通過MTT實(shí)驗(yàn)研究朱頂紅四部分提取物對HepG-2細(xì)胞活性研究發(fā)現(xiàn)，朱頂紅四部分提取物對人肝癌HepG-2均有抑制作用.研究分離得到純度較高兩個(gè)單體化合物，利用光譜學(xué)分析(MS、1H-NMR、13C-NMR)對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，確定了其中的兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)分別為(2S)-7,3'-二羥基-4'-甲氧基黃烷((2S)-7,3'-dihydroxy-4'-methoxy-flavan)，(2S)-7-羥基-3',4'-二甲氧基黃烷((2S)-7-hydroxy-3'',4'-dimethoxy-flavan)，這兩個(gè)化合物為首次從朱頂紅中分離得到.通過MTT法研究了朱頂紅中分離出的兩個(gè)化合物對人肝癌HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性.發(fā)現(xiàn)這兩種化合物對人肝癌HepG-2細(xì)胞均有抑制作用，且其抑制作用隨著劑量的增大而升高.

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