內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)皮瓣存活的研究進(jìn)展

李苗鐘 梅 勁 王 欣 章偉文

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寧波市第六醫(yī)院，浙江 寧波 315211)

目前皮瓣移植術(shù)在解決缺損覆蓋、塑型重建等方面發(fā)揮著巨大的作用。近年來，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，基于干細(xì)胞介導(dǎo)的治療性血管生成重建血運逐漸得到重視。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)作為血管前體細(xì)胞，在介導(dǎo)血管重建和恢復(fù)血運方面發(fā)揮著重要的作用〔1,2〕。本文就近年來EPCs促進(jìn)缺血皮瓣存活方面的研究進(jìn)展做一回顧。

1 EPCs參與血運重建

EPCs可來源于外周血、骨髓、臍帶血、脾臟、胎腎、胎肺、血管壁及脂肪組織中〔3～5〕。個體在出生后的血管再生從血管形成發(fā)展到血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是由EPCs動員、遷移、增殖及分化，在原位形成原始毛細(xì)血管網(wǎng)，而血管生成是在原本存在的血管網(wǎng)基礎(chǔ)上，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖并重塑，形成新的成熟血管。研究〔1，6～9〕顯示，EPCs促進(jìn)血運重建的作用可用于血管新生、內(nèi)皮再生、心血管病治療、缺血性部位的治療、腫瘤的治療、組織工程、基因治療等領(lǐng)域。

2 EPCs干預(yù)缺血皮瓣

2.1直接注射EPCs 血運障礙是皮瓣移植術(shù)后最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重者可大塊組織壞死或?qū)е率中g(shù)完全失敗，同時其他常見的并發(fā)癥還有：血腫，皮瓣撕脫和感染。這些并發(fā)癥的發(fā)生主要是由于靜脈回流不暢造成的。由于EPCs具有對缺血組織定向遷移的特性，不但可以歸巢聚集于心肌和缺血肢體，同樣也可以聚集于缺血的皮瓣，理論上應(yīng)具有良好的治療效果。

研究表明，在一些針對缺血皮瓣模型的研究中，增加損傷部位EPCs的數(shù)量能加快局部組織的血運重建，促進(jìn)皮瓣的存活〔10〕。骨髓源性或臍帶源性EPCs在近似圓形、正方形、長方形還是狹長形的隨意皮瓣研究中都能明顯加速皮瓣缺血、缺氧組織的血運重建，改善皮瓣缺血缺氧狀態(tài)，提高皮瓣存活面積及成活質(zhì)量，提高皮瓣毛細(xì)血管網(wǎng)密度，增加血管引流，改善皮瓣淤血狀態(tài)，從而保持組織較好的彈性和色澤〔11〕。EPCs在血管生長因子的誘導(dǎo)下，分化組成新生血管中約占26%的內(nèi)皮細(xì)胞〔12〕。EPCs能提高皮瓣存活面積，主要機(jī)制可能與其參與組成并促進(jìn)微血管新生有關(guān)。皮下注射可促進(jìn)形成局部新的微血管網(wǎng)，后者在皮瓣靜脈回流不暢、代謝物堆積、微循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行性惡化時能提供低流量的血流，建立微循環(huán)系統(tǒng)，促進(jìn)淤血組織的存活〔13〕。

2.2間接上調(diào)EPCs：生長因子 EPCs的動員、遷移、歸巢和增殖往往受多種生長因子、趨化因子、炎癥因子等因素的影響。堿性成纖維生長因子(bFGF)是維持EPCs表型的必需因子，缺乏時可影響后者形成管狀結(jié)構(gòu)的能力〔14〕。并且還能通過激活磷脂酶C-γ和血小板生長因子-BB通路促進(jìn)EPCs的遷移、增殖和分化〔15〕。有研究者〔16〕為研究EPCs對狹長窄蒂皮瓣模型的作用時，在皮下均勻注射重組人生長激素，觀察bFGF的表達(dá)和皮瓣的存活。結(jié)果表明注射重組人生長激素的大鼠皮瓣中bFGF表達(dá)及微血管數(shù)明顯增加，能間接通過EPCs的增殖促進(jìn)微血管新生，改善局部缺血缺氧狀態(tài)，擴(kuò)大皮瓣存活面積。同時還有一些研究人員通過基因轉(zhuǎn)染等方法研究EPCs和皮瓣存活之間關(guān)系。易成剛等〔17〕利用脂質(zhì)體介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)165基因體外轉(zhuǎn)染EPCs,并移植于裸鼠隨意皮瓣。觀察發(fā)現(xiàn),體內(nèi)EPCs數(shù)量有所增加,說明基因轉(zhuǎn)染后的EPCs在體內(nèi)增殖分化能力較強(qiáng),而且EPCs均整合入裸鼠的新生血管內(nèi)膜中。說明表達(dá)的VEGF165蛋白有明顯的促進(jìn)EPCs增殖的作用,同時VEGF可促使EPC 分化參與血管內(nèi)膜的修復(fù)。實驗表明，無論是直接應(yīng)用VEGF、重組人生長激素等生長因子或與之相關(guān)基因治療手段，促進(jìn)EPCs內(nèi)皮化，還是直接注射，增加EPCs的數(shù)量，都能加快血管形成和血運重建〔18〕。此外EPCs本身也可以分泌VEGF，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α等趨化因子，并且通過自分泌和旁分泌效應(yīng)促進(jìn)血管生成過程〔19〕，提高隨意皮瓣的存活率和存活面積、還能改善軸型皮瓣及游離皮瓣的遠(yuǎn)端血運情況、減少帶蒂皮瓣斷蒂時間的影響〔20〕、縮短皮瓣內(nèi)形成功能血管所需時間、加速擴(kuò)張皮瓣擴(kuò)張速度。

3 EPCs干預(yù)微血管病變

內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷和微循環(huán)出現(xiàn)障礙是微血管病變發(fā)生的基礎(chǔ)，糖尿病(DM)引起的DM足及DM潰瘍的始動因素正是內(nèi)皮損傷。而EPCs可大量增殖分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞并排列形成新的血管網(wǎng)，增加微血管的血流灌注。提示EPCs在治療微血管病變方面有潛在的應(yīng)用前景。腎臟是一個富有血管的臟器之一，常常作為微血管病變的靶器官。Yuen等〔21〕將健康大鼠造成慢性腎損傷模型，即右腎切除，左腎結(jié)扎兩根腎動脈分支達(dá)到2/3腎梗死，假手術(shù)組做雙腎剖腹探查及術(shù)后傷口縫合處理。實驗動物給予健康大鼠來源的EPCs移植，結(jié)果顯示腎功能明顯恢復(fù)，腎小球濾過率(GFR)明顯提高，效果與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類似。此外，EPCs能還能減少慢性腎損傷大鼠尿蛋白含量，增加腎小球與間質(zhì)的微血管密度，緩解腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化。后來有學(xué)者用DM小鼠來源的EPCs重復(fù)了上述研究，得到相似的結(jié)論，驗證了DM小鼠來源的EPCs同樣具有治療價值〔22〕。Zhang等〔23〕進(jìn)一步探討證明了無論是給予來源于非DM還是DM小鼠來源的EPCs，移植到DM腎病小鼠體內(nèi)后，均可減輕白蛋白尿的進(jìn)展和系膜基質(zhì)增生的程度。提示治療與微血管病相關(guān)的皮膚損害可以從改善微血管內(nèi)皮功能著手。楊晨等〔24〕通過EPCs移植小鼠后肢單側(cè)缺血模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過細(xì)胞移植后缺血后肢的毛細(xì)血管密度，血流灌注及壞死程度相較對照組有明顯改善。彭艷等〔6〕也對DM大鼠下肢缺血造模，得到了類似的結(jié)論。Kim等〔7〕將EPCs移植到4例患有Buerger病的患者上，發(fā)現(xiàn)治療后他們的靜息痛很快緩解了，4 w后壞死的皮膚損傷也完全愈合了，血流動力學(xué)方面也有很大變化，遠(yuǎn)端毛細(xì)血管的數(shù)量和管徑明顯提升，血管阻力明顯下降。EPCs在改善系統(tǒng)性疾病、創(chuàng)傷等引起的微血管病變和局部循環(huán)障礙中都能分化成內(nèi)皮細(xì)胞，參與微血管新生、血運重建，修復(fù)微血管網(wǎng)等，從而延緩疾病進(jìn)展，改善預(yù)后。

4 影響EPCs時作用發(fā)揮的因素

4.1EPCs的功能下調(diào)或數(shù)量減少 引起EPCs作用的發(fā)揮減弱的原因:①直接抑制了EPCs的生成或加快其凋亡；②細(xì)胞數(shù)量沒有變化，但是其功能有所下調(diào)。研究〔8〕發(fā)現(xiàn)高齡與缺血部位的血管重建能力降低有關(guān)，并且能導(dǎo)致心血管相關(guān)并發(fā)癥的高發(fā)和組織恢復(fù)能力的減弱〔9〕。有實驗表明高齡能下調(diào)EPCs的作用，并且其EPCs本身數(shù)量與年輕的大鼠相比并無顯著改變，經(jīng)過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這是和高齡大鼠體內(nèi)缺乏缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α穩(wěn)定劑有關(guān)，通過對高齡大鼠補(bǔ)充鐵鰲合劑去鐵胺就能夠逆轉(zhuǎn)這一作用，從而增加血流、改善缺血部位的血運情況〔25〕。

相反，在高血糖的狀態(tài)下，EPCs的敏感性被增強(qiáng)了，但是其數(shù)量和增殖能力大大減少了，總體的作用表現(xiàn)為減弱〔26〕。在以高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)相對缺乏的高脂血癥的患者中EPC的數(shù)量和功能都表現(xiàn)為下調(diào)，然而EPCs在HDL-C正常的高脂血癥患者中的數(shù)量和功能并未受到影響〔27〕。血管內(nèi)皮依賴性舒張素(EDV)在心血管防治中起著重要作用〔28〕，并且被證實為是EPCs的保護(hù)因素〔29〕。而EPCs在HDL-C正常的高脂血癥患者能維持正常的功能和數(shù)量，正是后者對EDV的保護(hù)作用。所以HDL-C是影響高脂血癥患者體內(nèi)EPCs作用的主要決定因素。除此之外，此類患者的EPCs還與C反應(yīng)蛋白(CRP)、活性氧(ROS)、酶的表達(dá)活性有關(guān)。吸煙能夠增加CRP、ROS的反應(yīng)，減少HDL-C、HDL-C，降低酶的活性。因此吸煙等引起長期慢性血管損傷、氧化應(yīng)激、HMG-coA還原酶增加的因素都是引起缺血時降低EPC作用的危險因素〔30〕。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶B(Akt)在缺血部位EPCs發(fā)揮血管重建的過程中起著中心環(huán)節(jié)的作用。研究人員〔31〕對轉(zhuǎn)染Akt基因和沉默該基因的對比研究發(fā)現(xiàn)，沉默組的EPCs募集和重建血管能力大大減弱，而轉(zhuǎn)染組比正常對照組的能力還要增強(qiáng)。并且凋亡蛋白Bim能使得EPCs凋亡，而叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)4能促進(jìn)Bim的上調(diào)，Akt的磷酸化能引起FOXO4的磷酸化，從而抑制EPCs的凋亡，增加募集和重建血管能力。因而任何能引起凋亡蛋白Bim的減少，或FOXO4表達(dá)下調(diào)，或Akt的非磷酸化都能引起EPCs數(shù)量的減少〔32〕。

4.2EPCs功能上調(diào)或數(shù)量增加 對高齡大鼠補(bǔ)充鐵鰲合劑去鐵胺，逆轉(zhuǎn)HIF-1α穩(wěn)定劑，能改善EPCs在缺血部位的發(fā)揮血運重建的功能，其中關(guān)于HIF-1α與EPC之間機(jī)制關(guān)系尚待進(jìn)一步的研究。另外在Akt-FOXO4-Bim這條途徑中，引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)增加，促進(jìn)Akt的磷酸化，減少凋亡蛋白Bim的生成均可增加EPC功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，音猬因子(shh)蛋白，他汀類、魚腥草等藥物能夠通過PI3K/Akt途徑刺激EPCs增殖、遷移，抑制其凋亡〔33，34〕。

HDL-C是EPCs的保護(hù)因素，而雌激素能夠上調(diào)HDL-C的表達(dá)，因而女性肥胖者體內(nèi)的EPC數(shù)量和質(zhì)量相對男性肥胖者要高。另外，一些細(xì)胞因子如VEGF，SDF-1α，缺血組織通過HIF-1α、胰島素樣生長因子(IGF)等也都能刺激增加EPCs的表達(dá)，增強(qiáng)后者的血管重建能力。也有研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)捏w育鍛煉，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)能增加血管抗損傷能力，增多血管因子的數(shù)量及加強(qiáng)EPCs修復(fù)重建血管功能的發(fā)揮〔35〕。

此外，一些血液循環(huán)中的因子如SDF-1α,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),白細(xì)胞介素(IL)-8和裂解酶均參與動員EPCs從骨髓中遷移到外周血液中。同樣，HIF-1α介導(dǎo)釋放單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1〔36〕和紅細(xì)胞生成素(EPO)〔37〕，后者與靶細(xì)胞上的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1受體(CXCR)-4結(jié)合從而促進(jìn)EPCs的遷移、歸巢和分化。

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