豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫學研究進展

田 原,王 建,王 嬌,陳丹清,金 森,洪春暉,王華琴,顧志剛

(江蘇省常州市武進區(qū)動物疫病預防控制中心,江蘇 常州 213000)

1 抗體應答

機體在感染PRRSV后7～9天誘導抗體應答,但是這種抗體應答能否抵御PRRSV感染還無法證明;血清中和抗體(NAbs)只在感染后期出現(xiàn),一般是感染28天后[1]。商品化的血清學試驗主要檢測N蛋白抗體,N蛋白很早出現(xiàn),但不能中和病毒,也沒有保護作用。大量最新研究發(fā)現(xiàn),抗非結構蛋白(Nonstructural proteins,nsps)抗體在感染早期出現(xiàn)。血清轉換試驗結果顯示NAbs能夠傳遞被動保護。NAbs阻止PRRSV經(jīng)胎盤感染仔豬,并為母豬和胎兒提供免疫力。但這種保護建立在高滴度的NAbs基礎上。重要的是：即使在檢測不到NAbs的情況下,它仍能提供保護,控制病毒血癥。

造成NAbs延遲的潛在機制包括以下幾個方面：a.多糖對糖蛋白(Glycoproteins,GPs)上N-連接的糖基化具有保護作用;b.中和表位的GP5上游存在免疫顯性的誘騙表位;c.病毒進入宿主細胞的抗體依賴性增強作用;d.下文所述的先天性免疫應答的抑制作用[2];e.原初B細胞程序化激活的抑制作用[3]。

自然感染或者疫苗免疫啟動的免疫對二次感染只能提供有限的保護。機體產(chǎn)生保護性的NAbs通常需要多次疫苗免疫或者重復感染病毒。NAbs對疫苗毒株具有特異性,即只對同源性毒株有效;異源性毒株感染時機體不產(chǎn)生或者只產(chǎn)生滴度很低的交叉中和抗體[4-5]。Robinson等人[6]發(fā)現(xiàn)感染過PRRSV的商品化母豬,其血清中有高滴度的NAbs,可以抵御多種(異源性)PRRSV毒株的感染。NAbs特異性表位的鑒定仍在研究之中;Lee等人[7]在滅活的雙低糖化GP5中加入佐劑研究免疫效果。這種改進的疫苗試驗結果顯示,用同源性病毒感染豬,其肺臟損傷減少、病毒RNA含量降低同時誘導產(chǎn)生更高滴度的NAbs。Trible等人[8]已經(jīng)用廣譜中和活性的方法鑒定了M蛋白上一種特殊的氨基酸。

2 抗PRRSV感染的先天性免疫應答

先天性免疫系統(tǒng)是宿主防御病毒感染的第一道防線。它包括物理屏障,比如皮膚和黏膜;免疫細胞,如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和自然殺傷性細胞(Natural killer,NK)。宿主先天性免疫系統(tǒng)的充分激活對任何病毒的入侵都至關重要,因為它可以阻止病毒復制,抑制病毒入侵黏膜組織,最重要的是可以啟動有效的適應性免疫應答清除胞內病原[9]。NK細胞屬于先天性免疫淋巴細胞,能夠非特異性清除機體的所有病毒感染細胞。幼齡仔豬的NK細胞為小到中型大小,缺少足夠的胞內顆粒物質[10];因此,盡管保育仔豬擁有更高比例的NK細胞,但是降低了NK細胞的細胞毒活性。

感染急性豬流感后,無論是感染還是活化的肺細胞都分泌高濃度的生物活性干擾素-α(Interferon-α,IFNα)、腫瘤致死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNFα)以及細胞因子-1(Interleukin-1,IL-1),這與臨床癥狀和病毒的有效清除同步。另一方面,大部分的豬因日齡和免疫狀態(tài)的差異會有不同程度的免疫下調和病毒清除不完全的情況,這是PRRSV感染無法誘導有效的先天性和適應性免疫應答的原因[1]。保育豬的先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全,對病毒入侵免疫系統(tǒng)的防御作用有限,因而比成年豬更易感染PRRSV。激活的先天性黏膜免疫應答對誘導腸道和呼吸道感染的保護性免疫具有重要作用。然而很多豬源性病毒先后改變了宿主的先天性免疫和適應性免疫,導致隱性感染。實際上,受PRRSV干擾的免疫系統(tǒng)容易繼發(fā)細菌性和豬呼吸道疾病綜合征(Porcine RespiratoryDisease Complex,PRDC)感染,從而造成嚴重的發(fā)病率。

某些PRRSV毒株的感染會嚴重抑制NK細胞的細胞毒活性[13]。讓人驚訝的是這種情況發(fā)生在感染后2天[14],并持續(xù)3～4周。那些感染特定毒株的豬都有NK細胞活性降低的現(xiàn)象,這些毒株包括野毒株MN184和MN 1-18-2、實驗室改造的活疫苗毒株VR2332以及通過非腸道途徑或者鼻腔感染的MLV-PRRS;這些豬都分泌低水平的IFNα[15]。

PRRSV誘導的NK細胞細胞毒性降低與NK細胞的比例無關[15],理由如下：盡管NK細胞的比例在PRRSV感染幾個星期后恢復到正常水平,但NK細胞的細胞毒性作用仍然受到抑制,這表明PRRSV改變了NK細胞的細胞毒活性[18]。感染期間多種細胞因子共同調節(jié)NK細胞的功能,包括IFNα/β,IL-12和IL-15。盡管原初NK細胞的數(shù)量正常,但其修復的基礎細胞毒活性是通過STAT1途徑進行的。

感染PRRSV的豬分泌的原始細胞因子在數(shù)量上比其他病毒少,并且具有毒株特異性。因而這種適應性免疫的激活是被推遲和抑制的。事實上幾種重要的血清細胞因子(如 IL-8、IL-1β、IFNγ)分泌情況與病毒含量密切相關,大約84%差異可以說明這一點[16]。PRRSV感染誘導機體分泌IFNα的能力很弱,IFNα在感染全程中水平都很低,野毒感染的豬都有這種情況[1]。體外試驗表明,病毒的非結構蛋白(nsp1、2、4、11)可以下調 IFNα 的刺激作用[17]?；蚪M學研究則顯示,所有PRRSV感染豬4 dpi(days post-inoculation,dpi)時血清中均能檢測到IFNα。 PHGC(PRRS Host Genetics Consortium,PHGC)21天的攻毒試驗顯示[17],在11-14 dpi血清IFNα上調的快速消解出現(xiàn)在那些病毒含量更低的豬體內。體外單核細胞和巨噬細胞的激活以及低水平的IFNα共同促進唾液酸粘附素(Sn/CD169)的表達,人們普遍認為唾液酸粘附素是巨噬細胞上的PRRSV受體。有意思的是巨噬細胞這樣微量的刺激在最初的2 dpi足以提高PRRSV感染效率20倍左右。在一項50頭豬的攻毒試驗中(這些豬均在普通環(huán)境中飼養(yǎng)),IFNα在感染早期分泌量很低,這一現(xiàn)象與大部分豬在2 dpi的病毒血癥檢測結果相吻合[14]。因此,PRRSV通過干擾NK細胞的功能和IFNα的分泌改變宿主的先天性免疫以使豬發(fā)病。

感染豬的細胞因子IL-4分泌量在2 dpi比對照組減少90%以上[14]。IL-4在鼠和人類是抗體產(chǎn)生必要條件,并且是Th2免疫應答的診斷標記。但它不是豬體B細胞的刺激因素;事實上IL-4阻礙了抗體和IL-6的產(chǎn)生,抑制了抗原介導的B細胞活化[19]。在呼吸道疾病中,IL-4能夠抑制多種炎性細胞因子的活性,在調節(jié)豬肺泡巨噬細胞的炎性活性中發(fā)揮重要作用。綜上所述,IL-4在豬體中的作用與鼠和人類不同,但它在PRRSV感染早期同樣參與宿主先天性免疫的調節(jié)。

3 抗PRRSV的適應性細胞免疫

近期的研究比較了不同毒力1型PRRSV毒株的免疫力。毒力型的Lena與其他1型PRRSV毒株(Belgium A or Lelystad=LV)相比,會導致更加嚴重的疾病[20]。Lena感染引起更為嚴重的病理變化,伴隨著肺部、淋巴結的IL-1α含量升高以及流入支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage,BAL)白細胞(嗜中性粒細胞、單核細胞)的增多。感染5周與對照組相比,所有攻毒豬的BAL中CD8+T細胞的含量更高,IFNγ分泌細胞數(shù)量更多。Lena毒株感染第一周誘導產(chǎn)生高水平的IL-1β、IFNα、IL-10、IL-12、TNFα 和 IFNγ mRNA[21]。 Lena 毒株的感染引起早期嚴重的炎性反應,主要是相關的病理變化;與其他1型毒株相比,機體對組織中的病毒清除更快,極有可能是病毒毒力所致[22]。這種差異可能導致巨噬細胞吞噬細菌的活性降低,進而引起繼發(fā)性細菌感染和PRDC[23]。對于不同的PRRSV毒株,其交叉反應強度因細胞毒性細胞CD8+IFNγ和CD8μFNγ+而不同。尤其在感染后,由于毒株的感染頻率和特異性IFNγ生產(chǎn)細胞的CD8表型差異,免疫反應有明顯差異。免疫后細胞因子的調節(jié)更依賴于疫苗接種或者感染狀態(tài),而不是毒株刺激的差異;從基因和蛋白水平來看,IL-10的表達量變化比TNFα相關性更大。

Xiao等人使用 IFNγ ELISPOT試驗證明,PRRSV特異性T細胞在感染后2周就能檢測到,與感染過程中或者感染后期淋巴組織中的T細胞數(shù)量沒有顯著差異。數(shù)據(jù)顯示,主要分布于扁桃體、胸部和腹股溝淋巴結的病毒含量在持續(xù)性感染中下降3～4個log。然而,組織中病毒含量與PRRSV特異性T細胞的比例并沒有明顯聯(lián)系。在評價分泌IFNγ-的CD8+T細胞反應時,病毒的特異性應答較弱,出現(xiàn)時間較晚[24]?？傊?PRRSV感染對淋巴組織中特異性CD8+T細胞比例的影響并未得到證明。鮮有資料表明有效的CD8+細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cells,CTLs)控制主要的PRRSV感染,病毒血癥清除后僅有抗PRRSV CTLs能被檢測到[25]。正如Loving等人指出,更多基礎的免疫學試劑(豬特異性單克隆抗體,主要的組織相容性復合體抗原聚合體,分類細胞系)用以解釋這些重要的問題。

病毒通過促進免疫抑制細胞因子IL-10和轉化生長因子 -β(Transforming growth factor-β,TGF-β)的分泌侵入宿主免疫系統(tǒng),這會抑制機體產(chǎn)生有效的細胞免疫。PRRSV感染引起嚴重的免疫抑制反應,導致Th1免疫應答的推遲。PRRSV N蛋白的免疫調節(jié)特性導致Foxp3+調節(jié)性T細胞(T-regulatory cells,Tregs)比例和IL-10表達的上調[26]。無論是活疫苗還是滅活疫苗都大幅度提高IL-10的基因表達[26];即使病毒血癥已清除,豬肺部的IL-10含量依然是升高的。Tregs的作用在慢性遷延性的HIV,丙型肝炎和乙型肝炎、EB病毒感染的確診中均有報導[27]。同樣地,PRRSV協(xié)同性的免疫抑制作用可能由IL-10、TGF-β和 Tregs介導[13,15,26)。 所有這些研究都表明PRRSV感染會干擾免疫分子的表達,導致適應性免疫功能減弱。

激活的的Tregs能夠抑制抗病毒免疫,并因此促進PRRSV感染,盡管從數(shù)據(jù)上看不是很一致。FoxP3+T細胞也可能包含在內[28,29]。B細胞和T細胞的凋亡可能是一個重要因素,但必須找到依據(jù)證實這一點;感染高致病性PRRSV的細胞凋亡可能是一個更重要的因素[30]。評估效應器對記憶T細胞群在抗PRRSV中的作用十分必要,這關系到后續(xù)是刺激機體產(chǎn)生保護性應答還是病理性應答。隨著更多的細胞和免疫試劑的普及,更多深入的研究將能解釋這些復雜的免疫調節(jié)問題。

Th17細胞是最近發(fā)現(xiàn)的第三種輔助型CD4+T細胞亞群,以表達IL-17A和IL-17F為特征。Th17細胞對于機體抵抗黏膜及上皮部位胞外細菌及真菌的感染十分關鍵,最新的研究表明,Th17細胞應答同樣有助于病毒的清除[31]。樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)受到抗原刺激后會前往附近的淋巴結并激活Th細胞。這些游動的DCs產(chǎn)生TGFβ和IL-6,它們與共刺激分子一起激活Th細胞分化,形成的 Th17細胞產(chǎn)生細胞因子 IL-17和 IL-21[32]。IL-17能夠誘導IL-6,IL-1p以及TNFa等防御性細胞因子的表達。IL-17通過上調抗菌肽的表達可直接殺滅入侵病原菌。IL-17甚至可以通過招募淋巴細胞、樹突狀細胞及其他免疫細胞至細菌感染的黏膜表面。IL-17A還可通過上調抗病毒分子 MxA及OAS的mRNA水平抑制病毒增殖(比如HBV)。

張龍[31]通過制備IL-17單抗建立了豬Th17細胞的鑒定方法,并對高低致病性PRRSV毒株感染豬只外周血、肺臟、淋巴節(jié)以及脾臟中的Th17細胞的變化情況做了分析。數(shù)據(jù)表明,高致病性PRRSV毒株(JXwn06)感染可導致豬外周血中Th17細胞亞群的減少,引起肺臟中Th17細胞數(shù)量的下降。研究還發(fā)現(xiàn),Th17細胞亞群的比例降低與肺臟中細菌載量升高有密切的關系。一項對Th17細胞分化所需的細胞因子研究表明,無論是高致病性還是低致病性PRRSV毒株感染豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs),其刺激Th17細胞分化所需的IL-6、TGF-β均下降,并且高致病性毒株對PAMs表達IL-6的抑制效應強于低致病性毒株。為了研究IL-17A因子對PRRSV病毒的增殖的影響,張龍用反向遺傳學技術構建了四株表達豬源IL-17A的PRRSV嵌合病毒。結果發(fā)現(xiàn),嵌合病毒傳代后病毒滴度均有下降,用其感染細胞的上清處理MARC-145細胞,可以抑制PRRSV體外增殖,這與慢病毒表達IL-17A的抑制效應一致。

4 展望

PRRSV是造成我國重大經(jīng)濟損失的豬病之一。該疫病難以完全控制的原因是RNA病毒的自然特性,即病毒容易發(fā)生變異同時呈現(xiàn)出基因和抗原的多樣性特征。這也表明我們對PRRS病毒的發(fā)病機理和宿主免疫認識還不夠[18]。

雖然在PRRSV的生物學和生態(tài)學上已經(jīng)取得重大進展,但對病毒與宿主的相互作用以及疫苗接種的復雜機制還未了解透徹,對B細胞和T細胞定向保護的關鍵免疫學指標以及病毒蛋白在分子、細胞機制中調節(jié)免疫應答的誘導和成熟方面還知之甚少[1,3]。PRRSV持續(xù)性感染是阻礙我們控制病毒感染和傳播的重要因素,目前的診斷方法(病原)無法區(qū)分持續(xù)性感染的動物。近期對PRRSV非結構蛋白的研究成果可以鑒別先天性免疫阻斷,這代表了疫苗和診斷方法開發(fā)的新方向[18]。

目前控制和消除PRRSV需要加強對新技術的研究,包括新型佐劑和免疫調節(jié)劑、改進的滅活工藝、納米粒子給藥體系、新型DNA和載體導向的亞單位疫苗以及病毒蛋白工程和免疫細胞靶向策略[33]。理想情況下,下一代PRRS疫苗將采納其中的幾種新技術,并且包含區(qū)分感染和免疫動物的標記,能夠確定陽性免疫應答。未來的研究需要結合基礎的病毒生物學和發(fā)病機理,宿主基因學以及免疫學以增進我們對PRRS的認識,這些將為防控策略提供科學依據(jù)。