水楊酸鹽對(duì)大鼠聽覺中樞代謝功能影響的研究△

易彬 鮑偉奇 石潤杰 左傳濤 吳聰 黃治物 吳皓

水楊酸鹽是一種臨床上常用的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥物，最常見的副作用為耳毒性和胃腸道反應(yīng)等。以往研究發(fā)現(xiàn)水楊酸類藥物除了直接對(duì)耳蝸產(chǎn)生影響外，也能穿越血腦屏障直接影響中樞系統(tǒng)[1～3]。

有關(guān)耳鳴產(chǎn)生機(jī)制的假設(shè)有許多種，隨著科學(xué)的進(jìn)展，越來越多的研究聚焦于耳鳴的中樞化機(jī)制[4, 5]。聽覺通路上任一部分(耳蝸、聽神經(jīng)及聽覺中樞等)的損傷和異常都可能成為耳鳴的誘因；中樞可塑性是指中樞為了主動(dòng)適應(yīng)和反應(yīng)外界環(huán)境各種變化，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，并維持一定時(shí)間的能力；中樞神經(jīng)系統(tǒng)在耳鳴形成和發(fā)展的整個(gè)過程中，通過自身的可塑性不斷地產(chǎn)生各種改變[6, 7]。之前許多學(xué)者以正電子發(fā)射斷層顯像/X線計(jì)算機(jī)體層成像(PET/CT)為研究手段，發(fā)現(xiàn)了一系列耳鳴狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝改變的影像學(xué)結(jié)果[4, 8, 9]，顯示了微型PET/CT(micro positron emission computed tomography，microPET/CT)在耳鳴中樞研究中的前景。為此，本研究擬通過對(duì)大鼠進(jìn)行水楊酸鈉腹腔注射建立耳鳴模型，以聽覺驚跳反射間隔前刺激抑制實(shí)驗(yàn)(gap-prepulse inhibition of the acoustic startle reflex，GPIAS)檢測耳鳴樣行為，再運(yùn)用microPET/CT觀察耳鳴大鼠相關(guān)腦區(qū)的大腦功能活動(dòng)狀況，為探討耳鳴的產(chǎn)生機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 8周齡SPF 級(jí)的健康雄性SD大鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)24只，體重180～300 g，耳廓反射陽性，無強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物應(yīng)用史，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為：正常對(duì)照組(等量生理鹽水腹腔注射)；急性注射組(400 mg/kg水楊酸鈉腹腔單次注射)；慢性注射組(200 mg/kg水楊酸鈉腹腔注射，每天兩次，間隔大于8小時(shí)，持續(xù)14天)；慢性恢復(fù)組(水楊酸鈉注射方法與C組相同，14天注射完畢后停止，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)14天作為恢復(fù)期)。水楊酸鈉購于上海Sigma-Aldrich公司，以生理鹽水溶解為100 g/L溶液。

1.2研究方法 急性注射組在注射兩小時(shí)后、慢性注射組在第15天上午(離最后一次注射間隔大于8小時(shí))、慢性恢復(fù)組在停止注射后第15天上午分別進(jìn)行GPIAS檢測和microPET/CT檢測，正常對(duì)照組直接按流程進(jìn)行檢測。檢測前所有大鼠均禁食8小時(shí)。

1.2.1聽覺驚跳反射間隔前刺激抑制實(shí)驗(yàn) GPIAS檢測在噪聲屏蔽良好的房間(聲壓級(jí)≤25 dB A)內(nèi)進(jìn)行。大鼠在實(shí)驗(yàn)時(shí)先置于透明有孔洞的樹脂玻璃制動(dòng)物固定裝置內(nèi)以限制其活動(dòng)，然后放入載有敏感壓電轉(zhuǎn)換器的隔音箱內(nèi)(MED-ASR-PRO1, 美國MED公司)；聲刺激信號(hào)由TDT(RZ6,美國Tucker Davis Technologies公司)產(chǎn)生，通過懸掛在固定器側(cè)方10 cm的高頻喇叭傳出。當(dāng)動(dòng)物發(fā)生驚跳反射后，身體的重力改變會(huì)通過壓電傳感器傳入系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)波形并自動(dòng)記錄和計(jì)算峰值。GPIAS實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)程的間隙空白插在刺激噪聲前100 ms，刺激噪聲為100 dB SPL的白噪聲，上升/下降時(shí)間5 ms，持續(xù)時(shí)間50 ms，背景噪聲為65 dB SPL的3個(gè)不同頻率(6、12、16 kHz)純音。實(shí)驗(yàn)間隔為30～35 s，避免前面刺激產(chǎn)生的不應(yīng)期影響動(dòng)物對(duì)后面刺激的反應(yīng)；無間隙空白的實(shí)驗(yàn)與上述順序一樣，間隙空白設(shè)為0 ms；每只大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)間約為30 min。GPIAS主要檢測指標(biāo)是前刺激抑制率(%)，表示聽覺驚跳反射間隔前刺激對(duì)驚跳反射的抑制程度，公式為GPIAS% =(1-gap/no gap)× 100%，其中g(shù)ap表示有間隙空白作為前刺激時(shí)誘發(fā)的波幅，no gap表示沒有空白僅有驚跳刺激時(shí)所誘發(fā)的波幅。

1.2.2microPET/CT掃描 應(yīng)用小動(dòng)物專用PET設(shè)備Inveon MM micro-PET/CT scanner (Siemens公司)進(jìn)行microPET/CT掃描。PET/CT顯像劑；氟化脫氧葡萄糖(18F-FDG)由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院PET中心制備。大鼠以異氟烷麻醉，尾靜脈注射18F-FDG溶液，放置于PET/CT系統(tǒng)中，注射完畢后45 min行microPET/CT掃描(約20分鐘)。實(shí)驗(yàn)過程中注意記錄大鼠的體重以及注射器內(nèi)的放射性劑量(在注射前后均進(jìn)行測量)，并記錄測量時(shí)間。

1.2.3microPET/CT數(shù)據(jù)采集及分析 對(duì)于microPET全身衰減校正圖像，采用OSEM3D/MAP算法根據(jù)CT圖像進(jìn)行相應(yīng)校正勾畫。先使用自動(dòng)匹配的剛性融合，必要時(shí)進(jìn)行手工調(diào)整。每只大鼠的圖像應(yīng)用PMOD 3.4(PMOD Technology, Switzerland)軟件進(jìn)行圖像分析并自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化，以和模板一致。應(yīng)用Schiffer圖集[10]覆蓋標(biāo)準(zhǔn)化的CT圖像以獲取模板內(nèi)58個(gè)腦區(qū)的18F-FDG平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值(mean standardized uptake values，mean SUV)，計(jì)算公式：SUV=[組織放射性濃度(kBq/cc)×體重(g)/ 有效注射放射性劑量(kBq)]。

采集下丘及聽皮層作為聽覺中樞區(qū)域，小腦作為非聽覺中樞的對(duì)照區(qū)域，共3個(gè)腦區(qū)作為感興趣區(qū)(regions-of-interest, ROIs)，取雙側(cè)平均值，電腦自動(dòng)顯示全腦(globe)平均SUV值，最終算出各腦區(qū)與全腦SUV比值以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)數(shù)據(jù)分布和方差齊性檢驗(yàn)，采用SPSS 18.0軟件(美國IBM公司)進(jìn)行獨(dú)立樣本Student’st檢驗(yàn)，行單因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)事后檢驗(yàn)；若方差不齊，則取Log10后進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠聽覺驚跳反射前抑制試驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，慢性注射組GPIAS值在12和16 kHz明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示該組大鼠出現(xiàn)耳鳴樣行為，造模成功；急性注射組和慢性恢復(fù)組的所有頻率GPIAS值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明單次注射水楊酸鹽未誘發(fā)大鼠耳鳴樣行為，且耳鳴樣行為在停止水楊酸鈉注射14天后消失(表1)。

表1 四組大鼠不同頻率背景聲下的GPIAS值±s)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2各組大鼠18F-FDG microPET/CT成像結(jié)果 四組的全腦區(qū)平均SUV值比較顯示，與正常對(duì)照組比較，急性注射組全腦區(qū)SUV值顯著升高(P<0.01)，慢性注射組輕微升高，慢性恢復(fù)組輕微降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示急性注射組呈現(xiàn)全腦代謝活躍狀態(tài)，而其他三組未出現(xiàn)顯著變化(表2，圖1)。

各腦區(qū)SUV與全腦SUV比值中，與正常對(duì)照組比較，慢性注射組下丘及聽皮層與全腦SUV比值明顯升高(P<0.01)，提示該組大鼠這兩個(gè)腦區(qū)神經(jīng)活躍度升高；小腦的比值則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。急性注射組的聽皮層腦區(qū)比值相對(duì)升高(P<0.01)，說明該組大鼠聽皮層神經(jīng)活躍度升高；下丘和小腦比值無明顯升高(P>0.05)；慢性恢復(fù)組全腦區(qū)SUV值或各腦區(qū)與全腦區(qū)SUV值比值與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，圖1)。

表2 四組大鼠全腦平均SUV值及各腦區(qū)與全腦SUV比值±s)

注：與正常對(duì)照組相比較，**P<0.01

3 討論

耳鳴的發(fā)生和發(fā)展都十分復(fù)雜，至今成因都不明確[6, 11～15],因此，找到其病因并進(jìn)行對(duì)癥治療非常值得研究。通常認(rèn)為耳鳴是外周病變和中樞病變共同作用的結(jié)果，耳鳴一般由耳蝸病變所引發(fā)，外周的異常傳入或者聽力損失都可引起聽覺通路上的神經(jīng)活動(dòng)性改變[16]，包括從耳蝸、聽神經(jīng)到最高級(jí)別的聽覺皮層中的每個(gè)部位；外周有耳鳴產(chǎn)生的基礎(chǔ)，中樞加重、放大了觸發(fā)因素的后續(xù)影響，甚至單純的中樞病變也可能產(chǎn)生耳鳴[3～6,17]。外周異常信號(hào)輸入后，聽覺中樞原本的穩(wěn)態(tài)被打破，進(jìn)而引起大腦興奮性和抑制性的失衡，中樞在自我維穩(wěn)中不斷產(chǎn)生可塑性變化以達(dá)到新的平衡，抑制性降低和/或興奮性增強(qiáng)進(jìn)一步導(dǎo)致中樞聽覺相關(guān)區(qū)域活動(dòng)性的改變(主要是增強(qiáng))，從而感知到持續(xù)的耳鳴[4, 18～22]。盡管對(duì)耳鳴的發(fā)生機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但已有的理論機(jī)制尚不能解釋所有的耳鳴現(xiàn)象，顯然還不夠全面和完善，需要從其他新的角度和途徑去研究耳鳴。

水楊酸鹽是應(yīng)用最為廣泛的建立耳鳴動(dòng)物模型的藥物之一[17～19, 23, 24 ]。臨床上服用水楊酸鹽類藥物的患者耳鳴和/或聽力下降的程度在開始服藥的最初幾天會(huì)逐漸增加，隨后平穩(wěn)、波動(dòng)或衰減，停藥后幾天內(nèi)通常會(huì)消失[18]，提示其導(dǎo)致的耳鳴和聽力下降是可逆的。目前常用動(dòng)物行為學(xué)方法檢測水楊酸注射建立耳鳴動(dòng)物模型是否成功[25]。從本研究結(jié)果看,反復(fù)多次的慢性水楊酸鈉注射組大鼠產(chǎn)生了耳鳴樣行為，說明耳鳴動(dòng)物造模成功。

作為動(dòng)物模型研究的新手段，microPET/CT的空間分辨率相較于PET/CT大大提高，可用于定量檢測大鼠腦中各主要結(jié)構(gòu)的代謝速度，也可用于半定量研究大鼠腦可塑性和腦激活。文中結(jié)果顯示，單次注射水楊酸鈉后2小時(shí)，急性注射組大鼠全腦都出現(xiàn)了活躍狀態(tài)，而三個(gè)腦區(qū)中僅聽皮層出現(xiàn)了相對(duì)性活躍，提示這可能是動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)或者是藥物對(duì)于聽覺系統(tǒng)的急性作用造成的。經(jīng)過14天反復(fù)多次注射水楊酸鈉后，在藥物代謝8小時(shí)后再對(duì)大鼠進(jìn)行microPET/CT檢測，可見慢性注射組雖然全腦整體活躍度(全腦平均SUV值)略微上升(與對(duì)照組比較，P>0.05)，但是非聽覺中樞區(qū)域的小腦活躍度并沒有變化，聽覺中樞的下丘和聽皮層卻都出現(xiàn)了相對(duì)性的代謝率上升，提示這兩個(gè)腦區(qū)相較于正常大鼠已經(jīng)形成新的活躍狀態(tài)；這與該組耳鳴行為學(xué)檢測結(jié)果相吻合。在近幾年的耳鳴動(dòng)物microPET研究中，Paul等[19]應(yīng)用水楊酸鹽(250 mg/kg)2天發(fā)現(xiàn)耳鳴大鼠下丘及聽皮層葡萄糖攝取率升高，而丘腦區(qū)域有所升高但未到達(dá)顯著差異；Wallhausser-Franke等[26]發(fā)現(xiàn)，耳鳴沙鼠除了聽皮層的神經(jīng)活躍度上升外，包括下丘及外側(cè)丘系在內(nèi)的其他皮層神經(jīng)活躍性都是下降的，與本研究結(jié)果有所差異。這兩項(xiàng)研究的耳鳴動(dòng)物模型與本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、水楊酸鹽使用方法和放射性核素種類都存在差異，這些都可能造成結(jié)果不同，尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來研究[4, 19, 26]；但是，大部分以耳鳴患者為研究對(duì)象的臨床PET研究支持聽覺相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)活躍度升高[4]，因此推斷，在中樞可塑性的引導(dǎo)下，聽覺中樞腦區(qū)的功能逐漸發(fā)生了相應(yīng)變化，其活躍度上升導(dǎo)致了持續(xù)耳鳴。

圖1 各組大鼠18F-FDGmicroPET/CT顯像圖片 注:左起一、二列為microPET顯像的反式軸狀位的下丘及聽皮層圖像,第三列為mi-croPET顯像的矢狀位小腦腦區(qū)圖像,第四列為microPT和CT顯像融合后的冠狀位圖像。

綜上所述，慢性注射水楊酸鹽可使大鼠產(chǎn)生耳鳴，且耳鳴大鼠下丘、聽皮層的葡萄糖代謝率上升，提示在中樞可塑性的作用下，中樞聽覺系統(tǒng)部分腦區(qū)呈現(xiàn)神經(jīng)活躍度升高的狀態(tài)，但是水楊酸鹽誘發(fā)耳鳴的完整機(jī)制及其他相關(guān)腦區(qū)的狀態(tài)、相互關(guān)系，需要更進(jìn)一步的研究去揭示。

1 Campbell S,Macqueen G.The role of the hippocampus in the pathophysiology of major depression[J]. J Psychiatry Neurosci, 2004, 29: 417.

2 Hu SS,Mei L,Chen JY, et al. Effects of salicylate on the inflammatory genes expression and synaptic ultrastructure in the cochlear nucleus of rats[J]. Inflammation, 2014, 37: 365.

3 Hu SS,Mei L,Chen JY, et al. Expression of immediate-early genes in the dorsal cochlear nucleus in salicylate-induced tinnitus[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol,2016,273：325.

4 Elgoyhen AB,Langguth B,De Ridder D, et al. Tinnitus: perspectives from human neuroimaging[J]. Nat Rev Neurosci, 2015, 16: 632.

5 胡守森，黃治物，吳皓，等. 水楊酸鹽誘發(fā)大鼠聽皮層中Egr-1基因表達(dá)的改變[J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2012, 20：561.

6 黃治物，吳皓.耳鳴中樞化機(jī)制與臨床診療[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2014, 28: 222.

7 Hu SS,Mei L,Chen JY, et al. Expression of immediate-early genes in the inferior colliculus and auditory cortex in salicylate-induced tinnitus in rat[J]. Eur J Histochem, 2014, 58: 2294.

8 Lockwood AH,Wack DS,Burkard RF, et al. The functional anatomy of gaze-evoked tinnitus and sustained lateral gaze[J]. Neurology, 2001, 56: 472.

9 Langguth B,Eichhammer P,Kreutzer A, et al. The impact of auditory cortex activity on characterizing and treating patients with chronic tinnitus-first results from a PET study[J]. Acta Otolaryngol(Suppl)，2006,556：84.

10 Schiffer WK,Mirrione MM,Biegon A, et al. Serial microPET measures of the metabolic reaction to a microdialysis probe implant[J]. J Neurosci Methods, 2006, 155: 272.

11 Baguley D,McFerran D,Hall D. Tinnitus[J]. Lancet, 2013, 382: 1600.

12 Langguth B,Kreuzer PM,Kleinjung T, et al. Tinnitus: causes and clinical management[J]. Lancet Neurol, 2013, 12: 920.

13 Eggermont JJ. The auditory cortex and tinnitus - a review of animal and human studies[J]. Eur J Neurosci, 2015, 41: 665.

14 王洪田，黃治物，李明，等.耳鳴診治基本原則與耳鳴習(xí)服療法[J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2007, 15: 346.

15 盛海斌，黃治物，吳皓.耳蝸突觸病變和隱性聽力損失 [J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2016, 24: 614.

16 Norena AJ,Eggermont J. Enriched acoustic environment after noise trauma reduces hearing loss and prevents cortical map reorganization[J]. J Neurosci, 2005, 25: 699.

17 Chen GD,Stolzberg D,Lobarinas E, et al. Salicylate-induced cochlear impairments, cortical hyperactivity and re-tuning, and tinnitus[J]. Hear Res, 2013, 295: 100.

18 Cazals Y, Auditory sensori-neural alterations induced by salicylate[J]. Prog Neurobiol, 2000, 62: 583.

19 Paul AK,Lobarinas E,Simmons R, et al. Metabolic imaging of rat brain during pharmacologically-induced tinnitus[J]. Neuroimage, 2009, 44: 312.

20 Roberts LE,Eggermont JJ,Caspary DM, et al. Ringing ears: the neuroscience of tinnitus[J]. J Neurosci, 2010, 30: 14972.

21 Schecklmann M,Landgrebe M,Poeppl TB, et al. Neural correlates of tinnitus duration and distress: a positron emission tomography study[J]. Hum Brain Mapp, 2013, 34: 233.

22 Huang ZW,Luo Y,Wu Z, et al. Paradoxical enhancement of active cochlear mechanics in long-term administration of salicylate[J]. J Neurophysiol, 2005, 93: 2053.

23 Jin Y,Luo B,Su YY, et al. Sodium salicylate suppresses GABAergic inhibitory activity in neurons of rodent dorsal raphe nucleus[J]. PLoS One, 2015, 10:e0126956.

24 Cazals Y,Horner KC,Huang ZW.Alterations in average spectrum of cochleoneural activity by long-term salicylate treatment in the guinea pig: a plausible index of tinnitus[J]. J Neurophysiol, 1998, 80: 2113.

25 Lobarinas E,Hayes SH,Allman BL. The gap-startle paradigm for tinnitus screening in animal models: limitations and optimization[J]. Hear Res, 2013, 295: 150.

26 Wallhausser-Franke E,Braun S,Langner G.Salicylate alters 2-DG uptake in the auditory system: a model for tinnitus?[J]. Neuroreport, 1996, 7:1585.