固原雞OVR基因部分SNPs位點(diǎn)檢測(cè)及分布規(guī)律分析

丁 偉 岳彩娟 馬麗娜 馬小明 安克龍2 王秉龍3 額爾和花

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.固原市彭陽(yáng)縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏固原 756500；3.固原市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，寧夏固原 756500）

卵母細(xì)胞卵黃生成受體（Occyte vitellogenesis receptor，OVR）介導(dǎo)極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）和卵黃生成素（vitellogenesis，VTG）到達(dá)卵母細(xì)胞，此受體最先發(fā)現(xiàn)結(jié)合 VLDL 或 VTG 而稱為（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）受體[1-2]，卵泡膜上的極低密度脂蛋白受體VLDLR，結(jié)合母雞肝臟合成的卵黃前體物極低密度脂蛋白（VLDL）和卵黃生成素（VTG），并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵細(xì)胞的成熟。

在禽類，VLDLR（即OVR）主要存在于卵母細(xì)胞表面，與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)，有研究表明[3-4]，VLDLR（即OVR）一個(gè)編碼區(qū)的單堿基突變（G/C）引起的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，導(dǎo)致VLDLR不能正常折疊，引起產(chǎn)蛋數(shù)急劇降低，甚至導(dǎo)致蛋雞不育，也有研究發(fā)現(xiàn)VLDLR[2-4]（即OVR）突變與雞開(kāi)產(chǎn)日齡、哈氏單位、蛋黃重及蛋黃比例呈極顯著及顯著相關(guān)，為了改良固原雞性成熟晚，開(kāi)產(chǎn)日齡遲等問(wèn)題，篩選了VLDLR即OVR基因的部分SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，為選育提高其產(chǎn)蛋性能提供分子標(biāo)記輔助作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

寧夏固原市彭陽(yáng)縣朝那雞良種繁育中心所飼養(yǎng)的固原雞種雞群及固原市農(nóng)科所選育群白羽和黑羽烏骨雞共230只，試驗(yàn)雞群均翅下靜脈采血約2ml，檸檬酸鈉抗凝，置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存用于DNA的提取。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

溫度梯度PCR儀，德國(guó) Eppendorf公司，5418型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司，凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIORAD公司，核酸濃度測(cè)定儀NanoDrop2000，Thermo Scientific，DYY-2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組 DNA 提取與引物設(shè)計(jì)

采用常規(guī)苯酚/氯仿/異戊醇抽提法從雞全血中提取基因組DNA。根據(jù) NCBI 和 UCSC 中雞VLDLR基因即OVR基因全序列GenBank 登錄號(hào)no：006127），并參考曹頂國(guó)[2][3][4]等人的研究使用 Primer 5.0 分別對(duì)外顯子6的8467位點(diǎn)G/A突變，內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G突變，內(nèi)含子2的3967位點(diǎn)T/G 突變?cè)O(shè)計(jì)OVR基因SNP位點(diǎn)分析3對(duì)基因擴(kuò)增引物，引物信息詳見(jiàn)表1，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 OVR基因片段擴(kuò)增引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.3.2 PCR擴(kuò)增及酶切檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系均為20μL：PCR Master Mix10μl，DNA模板（100ng·μL-1）1μL，上、下游引物（10μmol·L-1）各0.15μL，ddH2O補(bǔ)至20μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，退火45 s（各引物的退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸45 s，33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

引物e6F、e6R擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 XBaI進(jìn)行RFLP分析，引物IN17F、IN17R擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MvaI酶進(jìn)行RFLP分析，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系（總體積15uL）：XBaI（MvaI）0.5uL（10U·uL－1），10×BufferG.1uL，PCR產(chǎn)物8uL，ddH2O.5.5uL，37℃水浴過(guò)夜，2.2% 瓊脂糖凝膠電泳（110V，15min）檢測(cè)酶切產(chǎn)物。引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 HinfI進(jìn)行RFLP分析，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系如上述，37℃水浴3h或過(guò)夜。

1.3.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用PopGen32軟件分析每對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切基因型的頻率、等位基因頻率、觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Effective allele numbers，Ne），多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC），檢驗(yàn)Hardy-Weinberg 平衡定律。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測(cè)

圖1 引物e6F、e6R擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 引物e6F、e6R擴(kuò)增產(chǎn)物酶切檢測(cè)

用引物e6F、e6R擴(kuò)增OVR（即VLDLR）基因的外顯子6片段，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增片段與目的片段長(zhǎng)度（474bp）一致，且條帶清晰特異性好，對(duì)PCR產(chǎn)物XBaI酶切檢測(cè)OVR基因的外顯子6的8467位點(diǎn)G/A突變，檢測(cè)到AA基因型（474bp），BB基因型（273bp/201bp），AB基因型（474bp/273bp/201bp），AA型8467處堿基為GG，BB型8467處堿基為AA，而AB型8467處堿基為GA，酶切結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖3 引物IN17F、IN17R擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 引物IN17F、IN17R擴(kuò)增產(chǎn)物酶切檢測(cè)

如以上圖3所示，引物IN17F、IN17R擴(kuò)增片段與目的片段長(zhǎng)度（441bp）—致，且條帶清晰特異性好，對(duì)PCR產(chǎn)物MvaI酶切檢測(cè)結(jié)果如圖4，OVR基因的內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G突變檢測(cè)到三種基因型，AA基因型（441bp），BB基因型（313bp/128bp），AB基因型（441bp/313bp/128bp）。AA型堿基為AA，BB型堿基為GG，而AB型堿基為GA。

圖5 引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R擴(kuò)增產(chǎn)物

圖6 引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R擴(kuò)增產(chǎn)物酶切檢測(cè)

引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R擴(kuò)增產(chǎn)物大小如圖5所示與目的片段長(zhǎng)度（718bp）一致，且條帶清晰特異性好，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)含子2HinfⅠ酶切檢測(cè)，結(jié)果表現(xiàn)出1種基因型（265bp/453bp），在擴(kuò)增片段265bp處有一個(gè)固定的HinfⅠ酶切位點(diǎn)外沒(méi)檢測(cè)到其他突變位點(diǎn)。

2.2 固原雞OVR基因SNP位點(diǎn)遺傳特性分析

2.2.1 固原雞OVR基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分析

從表2可知，固原雞催OVR（即VLDLR）基因的外顯子6片段8467位點(diǎn)G/A突變?cè)诠淘u群體中等位基因A占優(yōu)勢(shì)，基因頻率為0.84，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，所以該處固原雞群體中主要以GG堿基為主，對(duì)OVR基因的內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G處檢測(cè)在固原雞群體中等位基因B占優(yōu)勢(shì)，BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，所以該處固原雞群體中主要以GG堿基為主。固原雞催OVR（即VLDLR）基因內(nèi)含子2的3967位點(diǎn)T/G 突變處檢測(cè)到1種基因型。

2.2.2 固原雞OVR基因SNP位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析

如表3所示，固原雞催OVR（即VLDLR）基因的外顯子6片段8467位點(diǎn)G/A突變卡方檢測(cè)結(jié)果顯示在固原群體中該位點(diǎn)處偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，該位點(diǎn)為低度多態(tài)，低雜合度。而OVR基因的內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G處卡方檢測(cè)結(jié)果表明，在固原群體中該位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，中度多態(tài)。

3 討論

固原雞是寧夏唯一的地方雞品種資源，屬優(yōu)質(zhì)地方肉蛋兼用雞，又與甘肅靜寧雞合并稱為靜原雞，主產(chǎn)區(qū)在甘肅省靜寧縣及寧夏回族自治區(qū)固原縣。固原雞就巢性非常強(qiáng)烈、性成熟晚，開(kāi)產(chǎn)日齡晚，產(chǎn)蛋率低，對(duì)其產(chǎn)蛋等生產(chǎn)性狀還沒(méi)有進(jìn)行針對(duì)性和系統(tǒng)性的選育。

已有研究表明[2-4]，雞 VLDLR（即OVR）突變與雞開(kāi)產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋數(shù)量、蛋品質(zhì)具有顯著性的影響，固原雞外顯子6的8467位點(diǎn)G/A突變，內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G突變，內(nèi)含子2的3967位點(diǎn)T/G酶切檢測(cè)及遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，外顯子6片段8467位點(diǎn)G/A突變處固原雞群體中主要以GG堿基為主，偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，該位點(diǎn)為低度多態(tài)，低雜合度，說(shuō)明所研究的基因位點(diǎn)群體遺傳多態(tài)比較低。

表2 OVR基因部分SNPs基因型及等位基因頻率

表3 OVR基因部分SNPs多態(tài)信息

而OVR基因的內(nèi)含子17的13876位點(diǎn)A/G處，固原雞群體中以GG堿基為主，為中度多態(tài)，雜合度也處在中度，說(shuō)明所研究的基因位點(diǎn)在固原雞群體中具有一定的遺傳多態(tài)，具有一定的選擇價(jià)值。

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