植物新品種DUS測試中近似品種的篩選方法

王紅娟 林清 蔣曉英 白文欽 官玲 吳紅

摘 要 隨著新版《種子法》的實施和植物新品種保護(hù)權(quán)收費的停征，植物新品種權(quán)的申請量逐年增長，植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測試機(jī)構(gòu)的工作量大幅增加。近似品種是特異性判定的基礎(chǔ)，快速準(zhǔn)確篩選近似品種是DUS測試工作高效有序開展的重要保證。綜述DUS測試中篩選近似品種的信息來源和篩選途徑，有助于品種測試機(jī)構(gòu)提高DUS測試的效率，縮短植物新品種權(quán)的授權(quán)周期。DNA分子標(biāo)記因其諸多優(yōu)點在近似品種篩選和特異性判定中發(fā)揮著重要的作用，最后提出未來DNA分子標(biāo)記研究的3個方向，為測試機(jī)構(gòu)和育種家開展相關(guān)工作提供參考。

關(guān)鍵詞 近似品種 ；特異性 ；技術(shù)問卷 ；DNA指紋 ；已知品種數(shù)據(jù)庫

中圖分類號 S338 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.009

Abstract With the implementation of the new edition of "Seed Law" and cessation of new plant variety right fee， the number of applications for new plant variety right has been increasing each year， resulting in substantial increase of the workload of DUS testing station. Similar variety is the base for the examination of distinctness of a variety. Quickly and accurately screening of similar varieties is an important guarantee for the efficient conduction of DUS testing. The data sources and ways of selection of similar varieties in the DUS testing were summarized， which would help the Station to improve efficiency of DUS testing and then shorten the period of authorization of new plant variety rights. The molecular markers are playing an important role in the similar variety selection and distinctness assessment. Three research directions of molecular markers for future research were put forward to give some hints to DUS test stations and breeders in the future work.

Keywords similar variety ； distinctness ； technique questionnaire ； DNA fingerprinting ； database for known varieties

中國于1999年加入國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV），履行1978年公約文本[1-2]。在中國，申請品種權(quán)的植物新品種應(yīng)當(dāng)在中國植物品種保護(hù)名錄范圍內(nèi)，且應(yīng)當(dāng)具備新穎性、特異性、一致性和穩(wěn)定性，并具有適當(dāng)?shù)拿Q[3]。植物新品種特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）測試，簡稱DUS測試。2016年1月1日開始實施的修訂版《種子法》規(guī)定，DUS測試是申請植物新品種權(quán)、主要農(nóng)作物品種審定和非主要農(nóng)作物品種登記等品種管理的基本技術(shù)依據(jù)。隨著中國植物育種者品種權(quán)意識的不斷增強(qiáng)和新品種保護(hù)權(quán)收費的停征，申請新品種保護(hù)的植物種類和品種數(shù)量呈逐年增長趨勢（圖1），僅2016年一年的申請量達(dá)2 523件，居UPOV成員第二位；2017年申請量則躍升至3 842件，預(yù)計能居UPOV成員首位。同時，申請品種審定和登記也要求出具DUS測試報告。因此，國內(nèi)DUS測試機(jī)構(gòu)的工作量大幅增加。

特異性審查是DUS測試的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)UPOV公約，一個品種明顯區(qū)別于申請時其他任何已知品種，則認(rèn)為該品種具有特異性。在實際測試中，把申請品種與所有已知品種進(jìn)行對比往往不現(xiàn)實。通常的解決方法為從已知品種中篩選出相關(guān)形態(tài)特征與申請品種最為相似的品種，即近似品種（Similar Varieties），通過種植試驗與申請品種相鄰種植進(jìn)行性狀比較。近似品種的選擇是DUS測試的重要環(huán)節(jié)，直接影響DUS測試特異性的判定。近似品種選擇不合理，往往會導(dǎo)致測試機(jī)構(gòu)的工作量增加，貽誤申請審批進(jìn)程。滕海濤等[4]概述了近似品種的選擇依據(jù)和方法，有較好的科普意義和指導(dǎo)作用。本文綜述篩選近似品種的信息來源和篩選途徑，有助于測試機(jī)構(gòu)判定申請品種的特異性，提高DUS測試的效率，縮短新品種權(quán)申請的授權(quán)周期。

1 篩選近似品種的信息來源

1.1 申請者提供的技術(shù)問卷

育種家申請品種保護(hù)時需要填寫技術(shù)問卷，提供申請品種的重要信息（表1）。這些信息對于DUS測試第一個周期的近似品種篩選非常重要。其中起作用最大的是品種的分組性狀（Grouping characteristic）。但是，只有當(dāng)申請者提供的品種信息準(zhǔn)確無誤，利用這些信息才能篩選到準(zhǔn)確的近似品種。事實上，育種家往往更關(guān)注和經(jīng)濟(jì)價值相關(guān)的農(nóng)藝性狀，對一些常見的DUS測試性狀如“花青甙顯色強(qiáng)度”等性狀缺乏觀測經(jīng)驗，對表達(dá)狀態(tài)的判斷很可能存在較大偏差。那么，要想充分發(fā)揮技術(shù)問卷信息在近似品種篩選中的重要作用，一方面，需要育種家咨詢DUS測試員或者植物學(xué)家等相關(guān)人員盡可能提供準(zhǔn)確的品種描述信息；另一方面，DUS測試員在利用技術(shù)問卷信息篩選近似品種時，應(yīng)能夠預(yù)見到某些性狀的表達(dá)狀態(tài)描述可能不準(zhǔn)確，從而設(shè)置較大的篩選范圍或者排除這些性狀，甚至在設(shè)計技術(shù)問卷性狀時避免使用這類性狀。

1.2 DUS測試數(shù)據(jù)

利用技術(shù)問卷中有限的信息通常會篩選到較多的近似品種。在完成第一個生長周期的測試后，測試員可以獲得申請品種所有測試性狀的數(shù)據(jù)，包括分組性狀。利用這些數(shù)據(jù)，首先可以驗證申請人提供的技術(shù)問卷信息是否準(zhǔn)確；其次可以重新篩選更相近的近似品種，用于第二個測試周期（圖2）。同時，申請品種在相同地點相同的試驗條件下進(jìn)行測試，獲得的性狀數(shù)據(jù)可比性更強(qiáng)，相互之間也可以比較篩選近似品種。

1.3 DNA數(shù)據(jù)

隨著新一代測序技術(shù)的迅速發(fā)展，水稻、玉米、小麥等許多作物的基因組、EST或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相繼被釋放。利用這些數(shù)據(jù)可以篩選SSR等分子標(biāo)記，輔助DUS測試。如李汝玉等基于谷子[5]和大白菜[6]全基因組序列分別開發(fā)30對和17對SSR核心引物，這些引物在基因組中分布均勻，多態(tài)性好，擴(kuò)增重復(fù)性好，可以用于谷子和大白菜的遺傳多樣性分析和品種鑒定等領(lǐng)域。SSR分子標(biāo)記因其諸多優(yōu)點，是UPOV官方認(rèn)可的構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的理想標(biāo)記之一，UPOV制定了相應(yīng)的技術(shù)文件指導(dǎo)其應(yīng)用[7]。SSR標(biāo)記在近似品種篩選和品種特異性判定中應(yīng)用最為廣泛[8-15]。如賴運(yùn)平等[13]利用篩選出的49對SSR引物對80份甘藍(lán)型油菜品種的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行分析，論證了利用SSR標(biāo)記篩選近似品種的可行性。張晗等[15]利用21對核心引物和21對擴(kuò)展引物對36個小麥品種進(jìn)行擴(kuò)增，計算兩兩品種之間的分子距離，當(dāng)分子距離小于0.2時，判定為近似品種。該方法具有諸多優(yōu)點，除了標(biāo)記多態(tài)性豐富、不受環(huán)境條件影響，還具有檢測便捷、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可以節(jié)約DUS測試的時間和經(jīng)濟(jì)成本，已成為國內(nèi)外許多植物近似品種篩選的重要手段。

2 篩選近似品種的途徑

2.1 利用已知品種表型性狀數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選

農(nóng)業(yè)植物品種DUS測試體系已建立統(tǒng)一的自動化辦公平臺和已知品種表型性狀數(shù)據(jù)庫（http：//www.cnpvpdus.cn/DUS/）。測試員可以利用技術(shù)問卷中的品種類型和分組性狀，以及第一測試周期采集的其他性狀進(jìn)行近似品種篩選（圖2）。系統(tǒng)提供了3個供篩選的數(shù)據(jù)庫：已知品種庫、測試數(shù)據(jù)庫和技術(shù)問卷庫，分別對應(yīng)已經(jīng)獲得授權(quán)的申請品種和公知共用的已知品種、安排了測試的申請品種及其近似品種、以及育種家提交申請時技術(shù)問卷中填寫的性狀數(shù)據(jù)。測試員應(yīng)當(dāng)在3個數(shù)據(jù)庫中逐一篩選近似品種，避免遺漏。在第一個測試周期之前，先利用技術(shù)問卷中的信息進(jìn)行初步篩選。其中，品種類型信息用來對品種分組，再利用分組性狀在屬于相同分組的品種中篩選近似品種。第一個測試周期之后，利用采集的性狀信息再次篩選更近似的品種。此外，測試員應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗對篩選結(jié)果進(jìn)行分析，保留準(zhǔn)確又盡可能少的近似品種。例如，某品種和申請品種在分組性狀或者一些重要的農(nóng)藝性狀上表現(xiàn)為近似，則應(yīng)保留為近似品種。

DUS測試分中心亦可構(gòu)建所在生態(tài)區(qū)的已知品種表型性狀數(shù)據(jù)庫，如濟(jì)南分中心自2000年開始對黃淮海地區(qū)主要農(nóng)作物品種進(jìn)行表型性狀數(shù)據(jù)采集，建立了黃淮海地區(qū)大豆[16]、玉米[17]等作物的參照品種數(shù)據(jù)庫，其中包括3 696份玉米品種。受到環(huán)境條件、性狀類型和觀測人員的影響，同一品種同一性狀的表達(dá)狀態(tài)代碼會發(fā)生波動。孫加梅等[17]通過對鄭單958等12份品種不同年份性狀表達(dá)狀態(tài)代碼的波動幅度的研究，將性狀分為4個穩(wěn)定性類別（表2），并據(jù)此制定了近似品種篩選時不同性狀每個代碼的篩選范圍，建立了基于表型性狀的個性化近似品種篩選方法，取得了較好的效果。

2.2 利用DNA指紋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)發(fā)布水稻等16種農(nóng)業(yè)植物基于SSR標(biāo)記的品種鑒定技術(shù)規(guī)程農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并采用標(biāo)準(zhǔn)中的SSR標(biāo)記，構(gòu)建了水稻、玉米、小麥、大白菜等作物的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，已經(jīng)具備利用DNA指紋數(shù)據(jù)篩選近似品種的條件。濟(jì)南分中心利用小麥已知品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫對其2013～2017年測試的小麥品種進(jìn)行近似品種篩選，把與申請品種間的遺傳距離小于0.2（或5個位點）的已知品種作為近似品種，與申請品種一起在田間種植比較。相較于常規(guī)利用表型性狀的篩選方法，該方法篩選出的近似品種數(shù)量減少了約一半，提高了近似品種選擇的準(zhǔn)確性，縮短了一年的測試周期，降低測試成本。國外的測試機(jī)構(gòu)也將DNA指紋數(shù)據(jù)用于油菜、辣椒、萵苣、玉米、小麥等作物的近似品種篩選和特異性判定[18-22]。

DUS測試依據(jù)的是表型性狀，但是植物性狀的表達(dá)極為復(fù)雜，品種間的遺傳相似性和表型相似性高度相關(guān)但并非是線性關(guān)系。也就是說，SSR基因型不同的品種可能表達(dá)出相同的表型性狀，反過來，SSR基因型相同的品種形態(tài)性狀可能存在明顯差異。因此，通常在第一個測試周期之前利用分子指紋數(shù)據(jù)篩選近似品種，然后利用第一個測試周期獲得的表型性狀進(jìn)行驗證，進(jìn)一步縮小近似品種的范圍（圖2）。

2.3 排除法

一些品種如玉米雜交種由于育種目標(biāo)的趨同化等原因，可能篩選到較多的近似品種。第一個測試周期后，利用GAIA法[23]可以排除一部分不近似的品種，以節(jié)約第二個測試周期的人力和物力成本（圖2）。GAIA法的原理是對第一個測試周期獲得的每個有差異的性狀進(jìn)行加權(quán)從而計算每對品種之間的表型距離。如果該距離大于“特異性+”（Distinctness Plus）閾值[24]，表明該品種與申請品種有明顯差異，不需要在第二個生長期繼續(xù)種植?！疤禺愋?”閾值的設(shè)定對測試員的要求比較高，只有熟悉該作物且DUS測試經(jīng)驗豐富的測試員才能設(shè)定合適的閾值。該閾值高于判定特異性所需的閾值水平，以確保達(dá)到或者超過該閾值的品種確實有明顯差異。

另一方面，育種人提交品種保護(hù)申請時，需要提交申請品種的代表性照片。照片提供的信息非常明確，如顏色分布、形狀、株形等信息，測試員可以利用這些照片排除明顯不近似的品種。該方法對觀賞植物近似品種的篩選和排除更為有效，但需要注意照片的拍攝質(zhì)量及照片對性狀反映的真實性問題[25]。DUS測試主管部門已經(jīng)制定水稻、玉米、花生和甘藍(lán)型油菜等農(nóng)業(yè)植物新品種DUS測試性狀照片拍攝規(guī)范[26-29]，育種家可以參考拍攝規(guī)范進(jìn)行照片拍攝。

3 展望

目前，表型性狀仍是篩選近似品種的主要依據(jù)。需要注意的是，受生態(tài)環(huán)境和不同測試指南版本的影響，在不同地點或者不同生態(tài)區(qū)測試的品種，以及測試年度跨度較大的品種相比較時，可能篩選出不合適的近似品種，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎對待。因此，加強(qiáng)已知品種數(shù)據(jù)庫的更新與維護(hù)，建立完善的已知品種數(shù)據(jù)庫非常重要。為此，應(yīng)當(dāng)長期開展已知品種的信息采集和整理工作，對于數(shù)據(jù)庫中已有但是其性狀信息采集時間較為久遠(yuǎn)的品種，應(yīng)當(dāng)重新采集其性狀信息，完善和更新數(shù)據(jù)庫。這對各測試分中心篩選合適的近似品種非常重要。

分子標(biāo)記在DUS測試中的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是應(yīng)用于輔助一致性和特異性判定。利用SSR等分子數(shù)據(jù)篩選近似品種具有標(biāo)記豐富、操作便捷、快速準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等諸多優(yōu)點。未來，分子方法篩選近似品種將成為DUS測試技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。以下3個方面應(yīng)作為重點研究的方向：（1）分子標(biāo)記的選擇。使用的分子標(biāo)記應(yīng)隨機(jī)并均勻分布于植物的基因組中。除了SSR這類以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的第二代分子標(biāo)記，還應(yīng)開發(fā)更多的尤其是以DNA測序為核心的第三代分子標(biāo)記，如功能基因標(biāo)記[30]和SNP[31]等。Jamali等[30]引入水稻籽粒長度、淀粉含量、香味和糊化程度的功能基因標(biāo)記，結(jié)果顯示除糊化程度外，其余3個功能基因標(biāo)記能夠很容易地將品種劃分為不同分組，也能夠?qū)ζ贩N進(jìn)行特異性評估。法國品種審定和種子檢測中心（GEVES）已將SNP分子標(biāo)記應(yīng)用于玉米自交系DUS測試近似品種的篩選和玉米品種庫的更新[25]。（2）數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建與完善。構(gòu)建已知品種的DNA分子數(shù)據(jù)庫應(yīng)至少設(shè)置兩組平行試驗，取結(jié)果相同的數(shù)據(jù)入庫。并驗證數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量，保證建成的數(shù)據(jù)庫錯誤率低于0.5%。（3）篩選閾值的確定。有研究認(rèn)為，當(dāng)樣品間差異位點數(shù)目≤2時，可判定為近似品種[32]。但是，差異位點數(shù)目和使用的標(biāo)記數(shù)量有密切關(guān)系，籠統(tǒng)地規(guī)定≤2個位點顯然不合理。張晗等[15]設(shè)置的閾值為遺傳距離<0.2（或5個位點），對于提高小麥近似品種的篩選效率起到了一定作用。UPOV提出利用傳統(tǒng)性狀的最小距離校正分子性狀的閾值水平。在該模式下，法國測試機(jī)構(gòu)綜合利用GAIA表型距離和分子距離，規(guī)定表型距離>6，或者表型距離為2-6且分子距離>0.2的品種對判定為具有明顯差異（http：//www.upov.int/meetings/en/topic.jsp？group_id=262）。此外，設(shè)置閾值時還應(yīng)當(dāng)考慮品種的不同類型（自交系、常規(guī)種、雜交種、綜合品種、群體等）。

值得一提的是，不少國家由申請人提供近似品種，測試機(jī)構(gòu)不再進(jìn)行篩選。相比測試員，申請人更熟悉申請品種的育種過程及其特征特性，清楚哪些品種與自己的品種更相似。因此，這種做法更加科學(xué)。國內(nèi)的測試機(jī)構(gòu)也要求申請人提供近似品種，陳紅[33]詳細(xì)闡述了申請人填寫品種權(quán)申請文件時如何選擇近似品種并恰當(dāng)?shù)仃愂隼碛?，對申請人有較好的指導(dǎo)意義。但由于申請人或?qū)破贩N的理解不準(zhǔn)確，或誤當(dāng)作品種區(qū)域試驗的對照品種，或抱著僥幸心理，提供的近似品種需要測試員鑒別和確認(rèn)。因此，僅靠申請人提供近似品種目前并不可行，仍需要測試機(jī)構(gòu)利用表型性狀和分子標(biāo)記篩選近似品種。

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