褪黑素在糖尿病視網膜病變中的作用及機制

顧佳怡 綜述 朱曼輝，桑愛民 審校

(1.南通大學附屬醫(yī)院眼科，江蘇 南通 226000；2.蘇州大學附屬理想眼科醫(yī)院白內障科，江蘇 蘇州 215000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病引起的一種常見的眼部并發(fā)癥，是導致發(fā)達國家勞動年齡人群失明的主要原因，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1]。在疾病早期，患者沒有自覺癥狀，病變累及黃斑區(qū)后才出現(xiàn)不同程度的視力減退。DR一直被認為是一種微血管疾病。DR的發(fā)病機制錯綜復雜，涉及多條細胞信號通路，包括多元醇途徑、蛋白激酶C激活、糖基化終末產物的積聚、氨基己糖途徑等[2-3]。高血糖是DR的主要危險因素。高血糖環(huán)境下視網膜中促炎細胞因子，趨化因子和黏附分子的活性增加，促進白細胞在血管壁黏附，進而導致血-視網膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)破壞和血管內皮細胞凋亡，引起視網膜內的炎癥級聯(lián)反應[4]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)和糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)進展的關鍵因子，視網膜缺血/缺氧通過激活缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)導致VEGF的上調[5]。高糖引起視網膜細胞中抗氧化酶如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等活性降低[6-7]。線粒體電子傳遞鏈功能障礙，電子傳遞鏈復合物I和III的電子異常丟失，導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高[8]。ROS水平升高可誘導細胞過度自噬，產生損傷作用。尤其在饑餓狀態(tài)下，H2O2誘發(fā)自噬，使毛細血管內皮細胞發(fā)生凋亡和壞死，引起血管損傷，最終導致DR的發(fā)生[9]。

目前針對DR的治療主要為視網膜光凝術和玻璃體切除術，但并非對所有患者都有效，且僅在疾病晚期中發(fā)揮一定治療效果。抗VEGF治療在DR患者中顯示出顯著的臨床益處，但大多數(shù)患者未能實現(xiàn)明顯的視覺改善。且由于抗VEGF劑的半衰期短，因此需要每個月或每2個月注射1次以確保療效。頻繁注射可能會增加眼內炎的發(fā)生率[10]。經濟負擔和患者依從性差也限制了抗VEGF藥物在臨床實踐中的使用。此外，使用大劑量抗VEGF藥物可能引起視網膜變性和神經膠質增生。且高通量RNA測序[11]分析表明VEGF拮抗作用可激活視網膜變性，炎癥和其他不良反應。因此，DR的治療仍然充滿挑戰(zhàn)性，研發(fā)針對DR發(fā)病機制的藥物是亟待解決的問題。

1 褪黑素及其作用

吲哚胺N-乙酰-5-甲氧基色胺，即褪黑素(melatonin，MT)，是一種幾乎存在于所有生命形式中的神經激素，主要調節(jié)脊椎動物的睡眠和季節(jié)性行為。除了對人類的睡眠-喚醒循環(huán)的調節(jié)外，MT在抗氧化防御，維持線粒體穩(wěn)態(tài)和減弱炎癥反應方面也起著重要作用。MT是一種高效的內源性抗氧化劑[12]。MT高抗氧化作用部分地歸因于其小分子尺寸以及親脂性和親水性，這使得它能夠輕易地通過所有的生物屏障，從而能在細胞及線粒體水平高效發(fā)揮作用[13]。盡管絕大多數(shù)的MT都是由松果體分泌的，但MT在許多松果體以外的組織均有合成，如眼部的視網膜感光細胞，睫狀體和晶狀體[14]。MT的生物學功能與G蛋白偶聯(lián)受體家族成員MT1和MT2有關。哺乳動物的視網膜感光細胞、視網膜水平細胞、角膜上皮、基質內皮和鞏膜等中均表達這2種受體[15-16]。研究[17-18]表明：MT通過抑制炎癥因子、抗氧化應激、調節(jié)內質網應激及自噬，從而對眼部起到保護作用。在各類眼部疾病的實驗和臨床模型中，MT已被證實具有神經保護劑的作用。

2 MT抑制炎癥作用

炎癥是一把“雙刃劍”，是宿主對組織損傷的防御反應，在短期內促進體內平衡，但如果觸發(fā)不當，尤其是慢性激活時，炎癥可能是有害的，并推動多種疾病的進展，如DR。炎癥在DR的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，促炎細胞因子的釋放和白細胞在視網膜毛細血管的瘀滯是DR發(fā)展的初始事件，多種炎癥介質和轉錄因子協(xié)同作用介導這種效應，例如細胞因子和趨化因子，包括白細胞介素6(IL-6)，IL-8，IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，補體系統(tǒng)及核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)[19]。MT除了是一種直接的抗氧化劑外，還可以發(fā)揮受體介導的信號作用，以減輕視網膜的炎癥和氧化應激。MT通過NF-κB途徑抑制促炎癥細胞因子和蛋白的產生，包括IL-1β，TNF-α和誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)，對DR起到很強的保護作用[17,20]。高血糖介導的氧化應激和促血管生成分子，例如VEGF對糖尿病性視網膜病的發(fā)生和進展很重要。MT可抑制高糖和IL-1β誘導的VEGF、細胞間黏附分子-1、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9的表達從而抑制炎癥反應和血管生成，對DR具有潛在的治療價值[21]。然而，MT對下調VEGF表達的潛在作用機制還缺乏直接證據(jù)。研究[22-24]表明MT可通過不同的刺激(包括TNF-α，IL-1β和氧化應激)阻止p38 MAPK的激活，從而改善各種炎癥條件和減少細胞凋亡。

高血糖可以通過線粒體功能障礙、不穩(wěn)定糖基化、葡萄糖自氧化和細胞內多元醇途徑等機制產生ROS[25]。ROS能夠刺激許多調節(jié)炎癥信號級聯(lián)的基因，因而可以引發(fā)和放大炎癥反應[26]。這些基因可能被ROS介導的NF-κB激活上調，進而調控多種酶基因，包括iNOS、環(huán)氧化酶2和促炎細胞因子[27]。而MT能夠限制線粒體運輸鏈中的電子泄漏，從而減少了氧還原為超氧陰離子自由基的能力，因而對DR的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護作用[28]。

3 MT抗氧化應激作用

在糖尿病狀態(tài)下，細胞內各種炎癥因子水平顯著提高，氧化和抗氧化系統(tǒng)以及體內炎癥因子的產生和清除失衡，對氧化應激及炎癥敏感的細胞信號通路將被激活，并進一步產生活性自由基和炎性因子等，導致一系列病理變化的發(fā)生[29]。在糖尿病大鼠視網膜中，谷胱甘肽和谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamic cysteine ligase，GCL)下調。GCL是谷胱甘肽生成的限速酶，注射MT可通過Akt磷酸化而升高GCL水平，進而提高Nrf2的活性[17,30]。相關研究[31]表明：MT可以通過降低血清羥自由基，減輕谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)以及刺激抗氧化酶(包括谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)來實現(xiàn)降低氧化應激的作用。MT通過PI3K/Akt-Nrf2信號途徑降低氧化應激，觸發(fā)該途徑可增加其他抗氧化劑的產生和通過抑制NF-KB激活級聯(lián)反應減少炎癥，從而調節(jié)神經炎癥，在糖尿病神經病變中發(fā)揮神經保護作用[20,32]。此外，MT治療阻止了糖尿病引起的SOD mRNA表達的降低和caspase-3 mRNA表達的增加，從而對視網膜神經細胞的凋亡起到有利的作用[20,33]。另一方面，MT治療后血管調節(jié)性細胞因子相應減少，例如缺氧誘導因子-1α，VEGF-A和色素上皮衍生因子，對糖尿病血管病變有一定的治療作用[34-35]。

DR中硝酸應激增加，NO通過iNOS上調而增加，形成過氧亞硝酸鹽，通過脂質過氧化分解，產生丙二醛。在糖尿病前期大鼠視網膜中，MT可以降低脂質過氧化和NOS活性及NO生成水平，還阻止了視網膜過氧化氫酶活性的降低從而清除過氧化氫，抑制羥基自由基的形成[36]。同時，MT及其代謝物具有抗脂質過氧化作用而能夠穩(wěn)定細胞膜以抵御自由基攻擊[37]。MT還可以中和高活性羥基自由基，例如單線態(tài)氧、過氧化氫和過氧亞硝酸鹽陰離子，它們在糖尿病期間的脂質過氧化中起主要作用[38]。與自由基相互作用后，褪黑激素通過轉化為具有自由基清除特性的不可逆且穩(wěn)定的代謝產物而引發(fā)清除級聯(lián)反應[39]。在糖尿病期間，視網膜膠質細胞反應性是早期致病事件之一。有學者[40]研究了MT對糖尿病大鼠視網膜膠質細胞反應性和脂質過氧化的影響，認為MT可以防止反應性膠質增生和丙二醛的積累從而減少基于氧化的神經毒性。MT還可以降低缺氧大鼠視網膜Müller細胞突起腫脹和星形膠質細胞終末足突、VEGF水平、NO生成和血管滲漏[41]。

在糖尿病視網膜中，線粒體因促凋亡蛋白(Bax)從細胞質轉移到線粒體中，而細胞色素c從線粒體滲出而變得功能失調。超氧化物的抑制可抑制葡萄糖引起的線粒體功能障礙，caspase-3活化和視網膜毛細血管細胞死亡。MT作為高效的抗氧化劑，可能可以通過抑制氧化修飾的DNA和硝基酪氨酸的積累以及視網膜中的毛細血管細胞凋亡來抑制糖尿病性視網膜病的發(fā)展，但還需要進一步證據(jù)說明[42]。線粒體的分裂和融合依賴于細胞的營養(yǎng)狀態(tài)，在高血糖條件下，線粒體分裂蛋白的表達增加，而線粒體融合蛋白的表達減少。此外，這些高血糖細胞還降低了線粒體鈣，但增加了胞漿鈣。而MT可以避免高血糖引起的線粒體分裂融合動力學和線粒體鈣水平的改變，從而防止STZ誘導的神經視網膜和視網膜微血管的損傷[43]。

4 MT抑制內質網應激和調節(jié)自噬作用

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是一種動態(tài)細胞器，通過控制脂質代謝、鈣儲存和蛋白平衡參與多種細胞功能。在應激情況下，ER環(huán)境受到損害，蛋白質成熟受損，導致錯誤折疊的蛋白質積累，從而產生一種特征性的應激反應，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。UPR保護細胞免受應激，有助于細胞內穩(wěn)態(tài)的重建；然而，在長時間的ER應激過程中，UPR的激活促進了細胞的死亡。ER應激源可以調節(jié)自噬，而自噬又根據(jù)情況誘導細胞存活或死亡[44]。滲出的、修飾的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)與周細胞丟失有關，周細胞丟失是DR的早期特征。進一步的細胞培養(yǎng)、動物和人體研究數(shù)據(jù)[45]表明：修飾的LDL誘導氧化應激和ER應激，并與DR的周細胞丟失有關。經修飾的LDL的另一個有害作用是通過氧化應激、ER應激和自噬誘導視網膜色素上皮細胞凋亡。高糖還可誘導視網膜Müller細胞自噬。然而，由于溶酶體功能紊亂，自噬體在細胞質中積聚，導致VEGF過度釋放和凋亡。自噬在DR中具有雙重作用：輕度高氧化糖化低密度脂蛋白誘導的應激具有保護作用，在更嚴重的應激下，它會促進細胞死亡[46]。MT通過濃度依賴的方式降低ER應激反應基因和蛋白的表達，從而減輕甲基苯丙胺誘導的ER應激，對膠質細胞死亡起到保護作用[47]。MT也可以與4-苯丁酸(ER應激調節(jié)劑)聯(lián)合治療緩解2型糖尿病的糖毒性，還可以通過抑制ER應激依賴性自噬來預防腦缺血/再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷[48-49]。然而MT在DR中通過緩解ER應激，調節(jié)自噬所起的作用缺乏直接證據(jù)，因此需要進一步的研究來闡明MT對DR視網膜自噬和ER應激的復雜調節(jié)機制。

5 結語

MT通過其強大的抑制炎癥作用以及抗氧化能力，從而減輕DR中炎癥及氧化應激所造成的損傷。MT能夠抑制高糖誘導的Müller細胞膠質反應及VEGF因子釋放，能夠延緩DR疾病發(fā)展[50]。MT還可以緩解內質網應激，調節(jié)自噬，從而保護DR中周細胞和視網膜色素上皮細胞。這些研究結果表明MT能夠在DR中發(fā)揮預防和治療作用，成為抗DR的有效的藥物。然而MT藥物在應用中仍有一些問題，比如口服用藥其生物利用度有限、血漿半衰期較短和亞型受體選擇性較低等[51]。因此研究及開發(fā)出代謝更穩(wěn)定、亞型高選擇性和副作用較小等特性的MT及其類似物尤為重要。最近MT的大部分專利申請都是針對睡眠障礙和/或晝夜節(jié)律相關的疾病[52]。對于DR及眼部疾病的療效還需要更詳細的描述以明確這類MT類似物的所有性質。