浙江近海鰓屬魚(yú)類形態(tài)描述及中國(guó)鰓屬魚(yú)類分子系統(tǒng)發(fā)育分析

肖家光 張少秋 高天翔, 韓志強(qiáng)

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 青島 266003; 2. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316000; 3. 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316021)

物種的準(zhǔn)確鑒定是開(kāi)展?jié)O業(yè)資源調(diào)查和管理以及漁業(yè)生物多樣性研究的基礎(chǔ), 也是海洋生物多樣性保護(hù)的重要內(nèi)容。由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和形態(tài)分類學(xué)家隊(duì)伍的持續(xù)縮減, 海洋生物分類學(xué)的發(fā)展舉步維艱。近年來(lái), 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展, DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)憑借其簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn), 逐漸成為生物分類研究中的熱點(diǎn)[1]。與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)相比, DNA條形碼在揭示隱存種、鑒定缺少形態(tài)數(shù)據(jù)或形態(tài)不易區(qū)分的物種方面優(yōu)勢(shì)明顯[2—4]。線粒體DNA的COⅠ基因長(zhǎng)度適宜、進(jìn)化速率慢且富含系統(tǒng)發(fā)育的信號(hào), 大多數(shù)動(dòng)物的COⅠ基因都能被通用引物所擴(kuò)增, 因此常被選作物種鑒定的條形碼[5—8]。

鯢屬(Sillago)魚(yú)類隸屬硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鯢科(Sillaginidae), 廣泛分布于印度洋-西太平洋近岸水域,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9,10]。目前, 全世界發(fā)布并描述鯢屬魚(yú)類33種, 中國(guó)沿海分布有12種, 其中較常見(jiàn)的有多鱗鯢Sillago sihama、少鱗鯢Sillago japonica、斑鯢Sillago aeolus等[4,9,11—13]。由于鯢屬魚(yú)類形態(tài)和體色相近, 使得該屬魚(yú)類的分類一直存在諸多問(wèn)題。澳大利亞魚(yú)類學(xué)家McKay和日本的學(xué)者Kaga曾根據(jù)魚(yú)鰾及骨骼等形態(tài)特征對(duì)鯢屬魚(yú)類的分類及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究[14,15], 但近緣類群以及部分種屬界限仍難以確定, 且以外部形態(tài)特征建立的分類系統(tǒng)迄今仍存有爭(zhēng)議。近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的成熟, 越來(lái)越多的鯢屬新種及隱存種被發(fā)掘(Sillago caudiculaKaga, Imamura& Nakaya, 2010;Sillago sinicaGao & Xue, 2011;Sillago suezensisGolani, Fricke & Tikochinski, 2013;Sillago shaoiGao & Xiao, 2016)[4,11—13]。這些新種分布較廣, 并都曾被誤認(rèn)為多鱗鯢。有關(guān)浙江近海的鯢屬魚(yú)類一直缺乏系統(tǒng)整理, 諸多魚(yú)類志和文獻(xiàn)中記載有多鱗鯢和少鱗鯢兩種[16—18]。本研究采集了浙江近海的411尾鯢屬魚(yú)類樣品, 結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和DNA條形碼對(duì)其物種組成、序列差異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了探究, 以期為浙江近海鯢屬魚(yú)類分類及資源保護(hù)提供更多的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用鯢魚(yú)樣品共計(jì)411尾, 其中229尾于2016年5月8日采自溫州近海, 舟山近海182尾鯢魚(yú)于2016年6月14日采集(圖1)。所有樣品經(jīng)形態(tài)學(xué)分類鑒定后取肌肉組織于95%酒精中固定, 樣品現(xiàn)保存于浙江海洋大學(xué)漁業(yè)生態(tài)與生物多樣性實(shí)驗(yàn)室。

圖1 鯢魚(yú)采樣地點(diǎn)示意圖Fig. 1 Sampling sites of Sillago species

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

形態(tài)學(xué)研究對(duì)所有樣品的主要可數(shù)與可量性狀進(jìn)行測(cè)定并觀察其形態(tài)特征。其中可數(shù)性狀包括: 背鰭鰭條、臀鰭鰭條、胸鰭鰭條、腹鰭鰭條、尾鰭鰭條、第一鰓弓鰓耙、側(cè)線鱗、側(cè)線上鱗和脊椎骨; 可量性狀包括: 體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、眼后頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、尾柄長(zhǎng)和尾柄高。所有可量性狀均由游標(biāo)卡尺測(cè)得并精確至0.1 mm。電子天平稱取樣品體重(精確至0.1 g)后解剖觀察魚(yú)鰾特征。

遺傳學(xué)研究經(jīng)形態(tài)鑒定后各種取適量肌肉組織, 采用酚-氯仿方法[19]提取基因組DNA, 將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100 μL蒸餾水中,4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜跀U(kuò)增線粒體DNACOⅠ片段的引物為L(zhǎng)5956-COⅠ: 5′-CACAAAGACATTGGC ACCCT-3′; H6558-COⅠ: 5′-CCTCCTGCAGGGTCA AAGAA-3′[20]。PCR反應(yīng)體系為25 μL, 包括1.25 UTaqDNA聚合酶, 各種反應(yīng)組分的終濃度為200 nmol/L的正反向引物; 200 μmol/L的dNTP, 10 mmol/L Tris (pH 8.3), 50 mmol/L KCl和1.5 mmol/L MgCl2;反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min; 94℃變性45s, 50℃退火45s, 72℃延伸45s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。以上反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照以排除DNA污染的情況。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(U=5 V/cm), 送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)得的COⅠ基因片段序列用DNAStar(DNASTAR, Inc)軟件包中的Seqman軟件進(jìn)行比對(duì),并輔以人工校正。使用MEGA 5.05計(jì)算所得序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率、轉(zhuǎn)換顛換頻率及其比率; 并基于Kimura-2-parameter (K2P)雙參數(shù)模型計(jì)算種間及各種內(nèi)的遺傳距離, 采用鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 經(jīng)1000次重復(fù)抽樣(Bootstraps)檢測(cè)其置信度。選取中國(guó)近海常見(jiàn)鯢屬魚(yú)種作為比較并擴(kuò)增其COⅠ基因序列, 與本研究所檢測(cè)的2種鯢屬魚(yú)類共計(jì)7種45個(gè)個(gè)體的COⅠ基因同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,另選取同科斑似鯢屬斑似鯢(Sillaginodes punctatus)的同源序列作為外群。本研究所分析物種的COⅠ基因及其相關(guān)信息見(jiàn)表 1。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

實(shí)驗(yàn)測(cè)得舟山近海182個(gè)個(gè)體都為少鱗鯢。其主要形態(tài)特征如圖2A: 體呈長(zhǎng)圓柱形, 稍側(cè)扁。吻部尖細(xì), 背部稍隆起, 腹側(cè)稍平直; 尾部細(xì)長(zhǎng), 尾柄較短。頭中大, 頰部寬大; 眼睛較小, 位于頭部?jī)蓚?cè)中上部, 眼上緣與頭部背緣平齊。頭背側(cè)眼前部?jī)蓚?cè)各具一鼻孔, 分離。口小, 前位, 上下頜前端近平齊。體背部青灰色, 頭部背側(cè)深色, 腹部近于白色。體側(cè)中部具一模糊鋸齒狀銀色條帶; 第一及第二背鰭近似透明, 背鰭前幾個(gè)棘之間具有黑色小點(diǎn),第二背鰭邊緣具黑色小點(diǎn); 胸鰭透明, 胸鰭基部銀白色不具有黑斑; 腹鰭和臀鰭淺白色或近似透明;尾叉較淺, 尾鰭深灰色, 邊緣偏黑。第一背鰭具X—XII硬棘; 第二背鰭具I硬棘及21—23軟條, 臀鰭具II硬棘及21—24軟條, 胸鰭具14—15軟條, 腹鰭具I硬棘及5軟條; 第一鰓弓外鰓耙3—5/7—10; 側(cè)線上鱗3—4, 側(cè)線下鱗8—10, 具68—73側(cè)線鱗; 脊椎骨數(shù)34—36。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得溫州近海229個(gè)個(gè)體都為中國(guó)鯢。其主要形態(tài)特征如圖2B: 體細(xì)長(zhǎng), 略側(cè)扁, 吻尖細(xì), 背部稍隆起, 腹部相對(duì)平直。中國(guó)鯢整體呈黃褐色,背側(cè)顏色深褐色, 腹部漸銀白色。背鰭2個(gè), 第一背鰭起點(diǎn)在胸鰭基部后上方, 具X—XII硬棘, 鰭膜上具有排列不規(guī)則的黑色小斑點(diǎn); 第二背鰭起始于體中央, 由I根硬棘和20—22根軟鰭條組成, 沿鰭條有3—4行規(guī)則排列的黑色小斑點(diǎn); 臀鰭淺黃色, 與第二背鰭相對(duì), 具有II硬棘和20—24根軟條, 鰭膜上具細(xì)小黑點(diǎn); 胸鰭細(xì)長(zhǎng), 向斜后方延伸, 腹鰭略呈三角形; 尾叉較淺, 尾鰭上下緣密布黑點(diǎn)。側(cè)線上鱗5—6, 側(cè)線鱗75—80; 脊椎骨37—39。

本研究對(duì)浙江近海少鱗鯢和中國(guó)鯢的主要可數(shù)與可量性狀做了比較(表 2), 并與參考文獻(xiàn)中的描述相對(duì)比。少鱗鯢頭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的26.38%—28.6%,吻長(zhǎng)為頭長(zhǎng)的36.1%—42.9%, 眼徑為頭長(zhǎng)的16.4%—21.3%, 眼間距為頭長(zhǎng)的14.3%—19.1%, 尾柄高為體長(zhǎng)的5.6%—6.8%, 尾柄長(zhǎng)為體長(zhǎng)的5.5%—9.5%, 胸鰭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的12.4%—18.6%, 腹鰭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的11.9%—18.5%。中國(guó)鯢頭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的23.5%—27.6%, 吻長(zhǎng)為頭長(zhǎng)的40.4%—46.1%, 眼徑為頭長(zhǎng)的14.8%—22.7%, 眼間距為頭長(zhǎng)的20.0%—27.3%, 尾柄高為體長(zhǎng)的6.2%—7.4%, 尾柄長(zhǎng)為體長(zhǎng)的7.9%—12.5%, 胸鰭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的12.0%—22.1%,腹鰭長(zhǎng)為體長(zhǎng)的11.4%—15.7%。

少鱗鯢魚(yú)鰾與中國(guó)鯢魚(yú)鰾形態(tài)存在明顯差異。少鱗鯢魚(yú)鰾(圖3A)具一個(gè)前部延伸, 位于鰾體前端中間, 與枕骨相連; 左右各具一前外側(cè)延伸, 皆伸向前部且一般比前部延伸略短; 具一個(gè)后部延伸, 細(xì)長(zhǎng)并向尾部延伸; 具一小管與肛門(mén)相連。中國(guó)鯢魚(yú)鰾(圖3B)具兩個(gè)前部延伸, 伸向前部且與枕骨相連; 兩側(cè)各具一前外側(cè)延伸, 前外側(cè)延伸分前后兩部分, 前部向體前部延伸, 纖細(xì), 與前部延伸等長(zhǎng)或略長(zhǎng), 后部沿鰾體向后延伸, 長(zhǎng)度因個(gè)體而異,達(dá)鰾體長(zhǎng)的1/3—2/3, 且延伸上具向外側(cè)的小刺狀結(jié)構(gòu), 數(shù)目不定; 具兩個(gè)后部延伸, 緊密并排向尾部延伸, 一般一個(gè)略長(zhǎng)于另一個(gè), 且兩后部延伸基部連接緊密; 具一小管與肛門(mén)相連。

表 1 本研究中鰓屬7種魚(yú)類的COⅠ基因信息Tab. 1 Information of COⅠgenes of 7 Sillago species in this study

圖2 少鱗鯢(A)和中國(guó)鯢(B)Fig. 2 Sillago japonica (A) and Sillago sinica (B)

2.2 COⅠ基因序列特征及其變異

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得鯢屬7種45個(gè)個(gè)體的COⅠ基因序列, 經(jīng)測(cè)序比對(duì)得到同源片段序列600 bp, 編碼氨基酸200個(gè), 沒(méi)有堿基插入和缺失, 序列長(zhǎng)度上不存在變異。全部位點(diǎn)中變異位點(diǎn)有193個(gè), 占32.17%; 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有192個(gè), 占32%; 不變位點(diǎn)有407個(gè), 占67.83%。平均堿基組成為A: 23.2%、T: 28.4%、C: 28.5%、G: 19.9%, A+T含量(51.6%)高于G+C含量(48.4%)。符合線粒體編碼基因核苷酸堿基構(gòu)成的基本特征[7]。其中, 密碼子第一位點(diǎn)G+C含量最高55.8%, 第二位點(diǎn)G+C含量為43.9%,第三位點(diǎn)G+C含量為45.6%。

表 2 少鱗鰓與中國(guó)鰓主要可數(shù)與可量性狀比較Tab. 2 The countable and measurable characters of Sillago japonica and S. sinica

圖3 少鱗鯢魚(yú)鰾(A)、中國(guó)鯢魚(yú)鰾(B)和多鱗鯢魚(yú)鰾(C)Fig. 3 Swim bladder of Sillago japonica (A), S. sinica (B) and S.sihama (C)

COⅠ序列核苷酸變異情況: 其中保守位點(diǎn)512個(gè), 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)56個(gè), 顛換位點(diǎn)32個(gè)。其中第二位點(diǎn)最為保守, 第三位點(diǎn)變異最大。鯢屬7種魚(yú)類COⅠ基因片段GC含量差異情況: 其中邵氏鯢G+C含量最高(51.1%), 灣鯢G+C含量最低(45.1%)。各種均為密碼子第一位點(diǎn)G+C含量最高。

2.3 種內(nèi)、種間遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育

采用MEGA 5.05, 基于Kimura-2-parameter計(jì)算7種鯢屬魚(yú)類的種內(nèi)和種間遺傳距離(表 3)。結(jié)果表明, 7種鯢屬魚(yú)類種內(nèi)遺傳距離為0.000—0.003,種間遺傳距離為0.119—0.223, 種間遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。其中最大遺傳距離出現(xiàn)在少鱗鯢和斑鯢之間, 最小遺傳距離出現(xiàn)在中國(guó)鯢和邵氏鯢之間。根據(jù)Hebert等[1]提出的物種鑒定最小種間遺傳距離標(biāo)準(zhǔn)(0.020), 使用COⅠ條形碼所識(shí)別出的浙江近海少鱗鯢和中國(guó)鯢鑒定準(zhǔn)確, 且兩者之間的遺傳距離為0.211。

基于COⅠ基因片段構(gòu)建的7種鯢屬魚(yú)類的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)顯示, 所有物種均聚為獨(dú)立分支, 且都具有較高的節(jié)點(diǎn)支持率。舟山近海少鱗鯢與青島膠南的少鱗鯢聚在一起, 且有共享單倍型;溫州近海中國(guó)鯢與東營(yíng)近海的中國(guó)鯢聚為一支, 共享一個(gè)單倍型。此外, 中國(guó)鯢先跟邵氏鯢聚類, 然后再和少鱗鯢聚在一起, 而與形態(tài)相近的多鱗鯢關(guān)系較遠(yuǎn)。

表 3 鰓屬7種魚(yú)類的種間遺傳距離(對(duì)角線以下)和種內(nèi)遺傳距離(對(duì)角線)Tab. 3 Net genetic distance (K2P) between (blow the diagonal) and within (on the diagonal) in 7 Sillago species

圖4 基于COⅠ基因構(gòu)建的鯢屬魚(yú)類NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree estimated by the Neighbor-Joining method based on COⅠ sequence data of 7 Sillago species

3 討論

本研究所用溫州和舟山近海411尾鯢魚(yú)樣品中,僅出現(xiàn)了少鱗鯢和中國(guó)鯢兩種, 并未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中記載的多鱗鯢[16]及其他鯢屬魚(yú)種。事實(shí)上, 多鱗鯢作為鯢屬中分布最為廣泛的種類, 其分布范圍遍及印度洋及西太平洋沿岸[9,14], 國(guó)內(nèi)許多文獻(xiàn)記載多鱗鯢在我國(guó)沿海均有分布[21—24]。然而, 有關(guān)多鱗鯢的原始描述模糊不清, 形態(tài)指標(biāo)與同屬其他種類互有交叉, 缺乏詳細(xì)的魚(yú)鰾描述, 這使得鑒定該種時(shí)會(huì)出現(xiàn)很大誤差。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的鯢屬魚(yú)種S. caudicula、S. sinica、S. suezensis和S. shaoi無(wú)一不是和多鱗鯢混在一起[4,11—13]。此外, 近年來(lái)我們一直在中國(guó)沿海廣泛采集鯢屬魚(yú)類樣品, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在我國(guó)福建晉江以北海域未發(fā)現(xiàn)多鱗鯢分布[25]。所以,廣泛分布的多鱗鯢極有可能包含多個(gè)隱存種; 在我國(guó), 真正的多鱗鯢僅分布于福建晉江以南海域。少鱗鯢作為一種分布范圍較廣的鯢屬魚(yú)類, 在我國(guó)黃渤海、東海及南海均有分布[9], 其形態(tài)特征與多鱗鯢有較明顯不同: 少鱗鯢側(cè)線上鱗3—4(不會(huì)達(dá)到5), 而多鱗鯢側(cè)線上鱗5—6。中國(guó)鯢作為2011年發(fā)布的新種, 可以根據(jù)側(cè)線鱗和脊椎骨數(shù)與多鱗鯢區(qū)分開(kāi)來(lái): 中國(guó)鯢側(cè)線鱗75—80, 脊椎骨37—39; 多鱗鯢側(cè)線鱗68—72, 脊椎骨34—35; 且三種鯢魚(yú)的魚(yú)鰾差異極明顯(圖3)。

DNA條形碼技術(shù)自提出至今已被廣泛應(yīng)用于鳥(niǎo)類、蜘蛛、魚(yú)類等眾多生物類群中[7,26,27]。該技術(shù)很好地克服了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類存在的缺陷, 已成為生物分類學(xué)研究中引人注目的新方向和研究熱點(diǎn)。本研究中7種鯢屬魚(yú)類均可以形成單系群,且各物種種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)的遺傳距離,這符合DNA條形碼技術(shù)鑒定物種的標(biāo)準(zhǔn)和前提[24]。最小遺傳距離出現(xiàn)在中國(guó)鯢和邵氏鯢之間(0.119),遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Hebert等[1]2003年通過(guò)研究DNA條形碼確定的基于COⅠ基因進(jìn)行物種鑒定的遺傳距離閥值(0.020)。由此證明COⅠ基因序列作為條形碼, 能夠用于鯢屬魚(yú)類的有效物種鑒定。分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示, 中國(guó)鯢先跟邵氏鯢聚類, 然后和少鱗鯢聚在一起, 而和形態(tài)相似的多鱗鯢親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 這和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果并不一致。事實(shí)上, 依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)得到的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一直備受爭(zhēng)議。Kaga[15]基于解剖學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的鯢科魚(yú)類系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究, 其結(jié)果與基于分子標(biāo)記的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也并不一致。因此, 在進(jìn)行鯢屬魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究時(shí), 不同的方法可能得到不一致的結(jié)果,基于序列構(gòu)建的基因樹(shù)可能會(huì)與物種樹(shù)有所不同,將傳統(tǒng)形態(tài)分類方法與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合可以準(zhǔn)確鑒別魚(yú)種, 為后續(xù)分類地位確定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。

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