中華鱘促性腺激素釋放激素受體基因cDNA序列的克隆及表達(dá)分析

王桂蘋(píng) 杜合軍 冷小茜 李創(chuàng)舉 曹 宏

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 三峽工程魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所, 宜昌 443100; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223)

促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)的cDNA序列最早是在小鼠(Mus musculus)中被克隆鑒定出來(lái)[1], 隨后在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母細(xì)胞中進(jìn)行了功能驗(yàn)證[2]。在魚(yú)類(lèi)中, 促性腺激素釋放激素(GnRH)參與了包括繁殖在內(nèi)的多個(gè)生理學(xué)進(jìn)程, 和哺乳動(dòng)物一樣, 通過(guò)其與GnRH-R相結(jié)合, 合成并釋放促性腺激素, 從而促進(jìn)性腺的成熟[3]。目前,GnRH-R基因序列已在多種魚(yú)類(lèi)上有相關(guān)報(bào)道,包括虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[4]、伯氏樸麗魚(yú)(Haplochromis burtoni)[5]、真鯛(Pagrus major)[6]、斑紋隱小鳉(Kryptolebias marmoratus)[7]、日本鰻鱺(Anguilla japonica)[8]、歐洲舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)[9]和革胡子鯰(Clarias gariepinus)[10]等。

中華鱘(Acipenser sinensis)是我國(guó)的一級(jí)保護(hù)動(dòng)物, 其隸屬于硬骨魚(yú)綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目、鱘科、鱘屬魚(yú)類(lèi), 國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危級(jí)(Endangered, EN)物種, 國(guó)際瀕危動(dòng)植物種貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ保護(hù)物種。其壽命長(zhǎng), 體型大, 初次性成熟年齡大(雌性: 14—26年; 雄性:8—18年), 產(chǎn)卵間隔期長(zhǎng)(約2—7年); 而且, 中華鱘是1種溯河洄游性魚(yú)類(lèi), 棲息空間跨度大, 種群一旦遭到破壞, 就很難恢復(fù)。近幾十年來(lái), 由于人類(lèi)活動(dòng)的影響(如過(guò)度捕撈、航運(yùn)、污染和水利工程等), 造成中華鱘的棲息地和產(chǎn)卵場(chǎng)遭到嚴(yán)重破壞,尤其是長(zhǎng)江中游葛洲壩水利工程和三峽工程的修建阻斷了中華鱘的產(chǎn)卵洄游路線, 導(dǎo)致中華鱘產(chǎn)卵量急劇減少, 野生資源量持續(xù)下降[11]。因此, 自20世紀(jì)80年代起, 我國(guó)學(xué)者對(duì)中華鱘進(jìn)行了資源動(dòng)態(tài)[11,12]、遺傳多樣性[13]、人工繁殖及幼魚(yú)的培育[14,15]等理論和應(yīng)用研究, 經(jīng)過(guò)30余年的不懈努力,目前, 已成功實(shí)現(xiàn)中華鱘全人工繁殖[16]。但是, 人工養(yǎng)殖成魚(yú)和親魚(yú)前期培育所需要的時(shí)間長(zhǎng)、人力、物力投入巨大。本研究通過(guò)基因同源克隆, 獲得了中華鱘GnRH-R基因的cDNA序列, 并對(duì)其序列特征、同源性、組織表達(dá)特征進(jìn)行了分析, 以期為進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)生殖調(diào)控功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于構(gòu)建垂體SMART cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的野生中華鱘由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所于2005年11月(中華鱘的繁殖季節(jié)) 于長(zhǎng)江中捕獲。其性別鑒定為雌性, 年齡鑒定為24 齡, 全長(zhǎng)303 cm, 體長(zhǎng)247 cm, 體重192 kg。養(yǎng)殖中華鱘取自中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所, 選取健康無(wú)損傷的3齡子二代中華鱘3尾, 經(jīng)麻醉、放血, 取心、肝、脾、腎、腸道、肌肉、精巢及腦組織, 在液氮中速凍,然后存放于-80℃冰箱備用。

1.2 垂體RNA的提取及SMART cDNA的合成

將中華鱘垂體組織取出后, 利用SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega)提取總RNA, 步驟詳見(jiàn)SV Total RNA Isolation System Promega操作手冊(cè), 中華鱘垂體SMART cDNA的合成步驟參照文獻(xiàn)[17]。

1.3 垂體庫(kù)的克隆、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

取合成好的中華鱘垂體SMART cDNA文庫(kù),對(duì)其進(jìn)行克隆, 測(cè)序分析, 具體步驟參照文獻(xiàn)[17]。將測(cè)序得到的SMART cDNA文庫(kù)中全部小于200 bp的測(cè)序結(jié)果廢棄不用, 對(duì)剩下的測(cè)序結(jié)果通過(guò)blastclust方法(ftp.ncbi.nih.gov/blast)進(jìn)行聚類(lèi)并通過(guò)CAP3軟件(http://seq.cs.iastate.edu/download.html)來(lái)進(jìn)行功能匯編。并和公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank里的蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析, 只有e-value值≤10-5的才被認(rèn)為是可靠的數(shù)據(jù)。

1.4 中華鱘GnRH-R基因的全長(zhǎng)cDNA序列的擴(kuò)增與序列分析

以中華鱘垂體SMART cDNA文庫(kù)為模板, 所用RACE PCR引物為: 3′-GnRH-R RACE-PCR:ATATCTCGAGCTAATGAAATACAGTACGGGG GTA; 5′-GnRH-R RACE-PCR: ATATCTCGAG CTAATGAAATACAGTACGGGGGTA; UPM: CTA ATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCAACGCAGAGT; 其具體RACE PCR步驟參照文獻(xiàn)[18]。

1.5 GnRH-R基因的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將所得序列利用Blast軟件進(jìn)行同源性分析, 利用ORF Finder查找開(kāi)放閱讀框, 并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列; 通過(guò)NetNGlyc 1.0軟件來(lái)預(yù)測(cè)N連糖基化位點(diǎn)。從GenBank中查詢出所有已有的魚(yú)類(lèi)GnRH-R基因cDNA序列, 利用Cluster X進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì), 并以米氏葉吻銀鮫的GnRH-R為外類(lèi)群(NP_001279833), 用Mega 4 軟件中的鄰接法(Neighbourjoining)及最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony)對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 用自展法(Bootstrap) 進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)評(píng)估, 一致性指數(shù)(Consistency index,CI)來(lái)衡量分析結(jié)果的可靠性。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega) 提取中華鱘的心、肝、脾、腎、腸道、精巢、肌肉及腦組織用于組織表達(dá)特征研究; 步驟詳見(jiàn)SV Total RNA Isolation System Promega操作手冊(cè)。所得總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè), 取各組織總RNA 0.1 μg, 利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及oligo (dT)18引物(Promega), 按操作說(shuō)明將其合成第1鏈cDNA, 以此為模板。熒光定量PCR采用引物為:GnRHR-rtime-F: GAATGTCACAGTTCAGT GGCTCG;GnRHR-rtime-R: TTTCTTCTTCGCT TCGTTGATG; 內(nèi)參引物為: β-actin-F: TGGACT TGGCTGGTCGTGAC; β-actin-R: CTGGCAGCT CATAGCTCTTC。其他具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果

2.1 中華鱘GnRH-R基因的cDNA全長(zhǎng)序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

中華鱘GnRH-R基因cDNA全長(zhǎng)1530 bp, 有478 bp的5′非翻譯區(qū), 579 bp的開(kāi)放閱讀框和473 bp的3′非翻譯區(qū), 編碼192個(gè)氨基酸, 在poly (A)尾巴前18 bp處有一個(gè)典型的加尾信號(hào)(AATAAA)。通過(guò)軟件NetNGlyc 1.0進(jìn)行N連糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè), 結(jié)果表明,GnRH-R的氨基酸序列存在5個(gè)潛在的N連糖基化位點(diǎn)(Asn2、Asn24、Asn 37、Asn 91和Asn 111)。該序列的NCBI Bank ID是2033544。

2.2 中華鱘GnRH-R基因氨基酸序列的同源性分析

運(yùn)用BLAST軟件對(duì)中華鱘GnRH-R蛋白進(jìn)行了氨基酸序列同源性分析(表 1)。結(jié)果表明, 在所有序列中, 和中華鱘GnRH-R的氨基酸序列相比較, 同源性范圍為 39%—76%, 其中, 與真鯛GnRH-R的同源性最高, 為76%, 而與軟骨魚(yú)類(lèi)——米氏葉吻銀鮫的GnRH-R的同源性最低, 為39%。

我們將中華鱘GnRH-R和其他魚(yú)類(lèi)的GnRHR的氨基酸序列進(jìn)行了分析。利用Mega 4.0 軟件,分別利用鄰接法及最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)(圖1)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 以銀鮫目的米氏葉吻銀鮫為外類(lèi)群, 鰻鱺目的日本鰻鱺、鲇形目的革胡子鯰、鮭形目的虹鱒, 以及鱸形目的伯氏樸麗魚(yú)可以聚類(lèi)為一個(gè)分支; 中華鱘則與腔棘魚(yú)目的矛尾魚(yú)(Latimeria chalumnae)與其他魚(yú)類(lèi)如鳉形目的斑紋隱小鳉、底鳉(Fundulus heteroclitus)以及鱸形目、鰈形目、鲉形目等代表物種聚為另一個(gè)分支。從圖中的結(jié)果看, 雖然兩棵樹(shù)之間存在一些細(xì)微差異, 主要體現(xiàn)在有幾個(gè)支持率比較低的節(jié)點(diǎn)上, 但是幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的支持率還比較高, 在90%以上, 例如, 以銀鮫目的米氏葉吻銀鮫為外類(lèi)群, 鰻鱺目的日本鰻鱺、鲇形目的革胡子鯰、鮭形目的虹鱒, 以及鱸形目的伯氏樸麗魚(yú)可以聚類(lèi)一個(gè)分支, 2棵進(jìn)化樹(shù)都顯示這幾個(gè)物種聚類(lèi)為一個(gè)分支, 支持率分別為100%和97%。

表 1 中華鱘的GnRH-R基因與其他魚(yú)類(lèi)氨基酸同源性比較Tab. 1 Amino acid identities of GnRH-R of Chinese sturgeon and other fishes

圖1 基于鄰接法(a)和最大簡(jiǎn)約法(b)構(gòu)建的魚(yú)類(lèi)GnRH-R的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Unrooted phylogenetic trees [Neighbour-joining (a) & Maximum parsimony (b) of the deduced amino acid sequence of GnRH-R of Chinese sturgeon and other fishes]

2.3 中華鱘GnRH-R基因的組織表達(dá)分析

在3-齡的雄性中華鱘中對(duì)GnRH-R基因的組織表達(dá)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)其在精巢中大量轉(zhuǎn)錄, 其精巢已發(fā)育至II期; 在肌肉和腦組織中可以檢測(cè)到微量的GnRH-R基因的mRNA; 而在心、肝、脾、腎及腸道等組織中幾乎無(wú)法檢測(cè)到其mRNA (圖2)。

3 討論

本研究通過(guò)基因同源克隆和RACE方法, 獲得了中華鱘GnRH-R基因cDNA全長(zhǎng)序列, 這也是該基因序列首次在鱘形目魚(yú)類(lèi)中的報(bào)道。中華鱘是一種原始的硬骨魚(yú)類(lèi)。通過(guò)將其GnRH-R基因的氨基酸序列與其他已登記在NCBI上的魚(yú)類(lèi)GnRH-R氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)后, 我們發(fā)現(xiàn)鮭形目, 鲇形目和鰻鱺目的物種, 其GnRH-R可以聚為一類(lèi), 而中華鱘與同屬古老硬骨魚(yú)類(lèi)的矛尾魚(yú)一起, 與其他硬骨魚(yú)類(lèi)可以聚為一類(lèi)。這是否意味著硬骨魚(yú)類(lèi)的GnRH-R在進(jìn)化過(guò)程中有著2個(gè)不同的演化方向, 值得在今后的工作中進(jìn)行更深入的探討。

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法, 檢測(cè)其在3齡雄性中華鱘中的表達(dá)特征, 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 中華鱘GnRH-R基因在精巢中大量轉(zhuǎn)錄, 和我們之前的報(bào)道[18]相吻合的是, 其精巢已發(fā)育至II期, 暗示其在性腺發(fā)育特別是精子發(fā)生過(guò)程中可能起重要作用。但是其在腦組織的表達(dá)微弱, 而在其他硬骨魚(yú)類(lèi)如斑紋隱小鳉[7]中, 其GnRH-R基因在腦組織和性腺中均有較高的mRNA的表達(dá)水平。在虹鱒[4]中, 該基因則在視網(wǎng)膜, 大腦, 卵巢中均有較高的mRNA的表達(dá)水平。由于中華鱘物種非常珍貴, 無(wú)法獲得新鮮的野生樣本, 而人工養(yǎng)殖的中華鱘也不易取材,所以本研究所用樣本數(shù)較少, 此結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前, 養(yǎng)殖中華鱘個(gè)體較野生的偏小、懷卵量少, 絕對(duì)繁殖力下降明顯; 性腺發(fā)育往往僅停留在Ⅱ期, 很難向Ⅲ期或者Ⅳ期過(guò)渡, 其性腺發(fā)育至Ⅲ期普遍需要10年以上時(shí)間。同時(shí), 由于中華鱘的壽命長(zhǎng), 體型大, 相比較人工養(yǎng)殖的施氏鱘(初次性成熟年齡: 雌性: 9—11年; 雄性: 6—7年), 中華鱘初次性成熟年齡大(雌性: 14—26年; 雄性: 8—18年),產(chǎn)卵間隔期長(zhǎng)(約2—7年)。因此, 急需縮短中華鱘的初次性成熟年齡和繁殖周期, 并提高懷卵量和繁殖力。GnRH與GnRH-R的主要作用是促進(jìn)促性腺激素的釋放, 并促使性腺發(fā)育成熟, 但是其在中華鱘這一古老物種中的具體調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。本研究結(jié)果為中華鱘生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、GnRH-R基因結(jié)構(gòu)與功能探討、魚(yú)類(lèi)GnRHR進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

圖2 GnRH-R的mRNA在中華鱘各個(gè)組織中的表達(dá)差異Fig. 2 Relative expression of GnRH-R mRNA in heart, liver,spleen, kidney, testis, muscle, intestine and brain of Chinese sturgeon

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