灌喂氧化魚油后黃顙魚胃腸道黏膜黑色素細(xì)胞分化和黑色素合成途徑基因的差異表達(dá)

葉元土 吳 萍 蔡春芳 吳代武 羅琪剛 何 杰 高敏敏 周露陽王夢影 汪 冰 張寶彤 蕭培珍

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘇州 215123;2. 北京營養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營養(yǎng)研究開放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100000)

魚類的色素細(xì)胞、色素細(xì)胞中的色素是其體色形成的基礎(chǔ)。黑色素細(xì)胞的增殖不是源于成熟的黑色素細(xì)胞有絲分裂, 而是源于神經(jīng)嵴(Neural crest)細(xì)胞的分化和發(fā)育, 來源于神經(jīng)嵴的干細(xì)胞需要遷移到皮膚、眼睛、腹膜等位置分化、發(fā)育,經(jīng)歷了神經(jīng)嵴干細(xì)胞、前黑色素細(xì)胞、幼小黑色素細(xì)胞、成熟黑色素細(xì)胞等基本的分化和發(fā)育過程[1,2]。魚類成熟的黑色素細(xì)胞主要分布在眼睛、皮膚、鱗片、腹膜等處, 成熟的黑色素細(xì)胞顯微鏡下為樹突狀結(jié)構(gòu), 細(xì)胞中的黑素體是由黑色素聚集形成的顆粒狀結(jié)構(gòu)。鱗片、皮膚黏膜下層中成熟黑色素細(xì)胞密度、黑色素細(xì)胞中黑素體分布位置等決定了魚體黑色體色。

養(yǎng)殖魚類的體色也影響其市場價(jià)格, 正常體色也是魚體生理健康的反映[1]。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是主要養(yǎng)殖魚類之一, 其體色容易受到自身生理狀態(tài)、疾病、水質(zhì)條件、飼料質(zhì)量等的影響, 尤其是飼料油脂氧化產(chǎn)物成為飼料途徑影響?zhàn)B殖魚類體色變化的主要因素[1]。由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化、發(fā)育為成熟的黑色素細(xì)胞, 以及黑色素的合成等受到魚體自身內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和外界環(huán)境的控制和影響, 其代謝過程也是受到嚴(yán)格的、系統(tǒng)的基因表達(dá)活性所控制和調(diào)節(jié)[2]。研究魚類色素細(xì)胞的分化、發(fā)育和色素合成代謝途徑的基因表達(dá)活性, 既是魚類基礎(chǔ)生物學(xué)的需要, 也是養(yǎng)殖魚類正常體色維護(hù)與調(diào)控的需要。對部分養(yǎng)殖魚類色素細(xì)胞、黑色素合成過程中主要酶和蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)有過不同的研究[3,4], 但尚未有系統(tǒng)化的基因信息、基因差異表達(dá)等研究。魚體胃腸道黏膜是代謝活躍的器官組織, 也是黑色素合成代謝的主要器官組織之一。本文以灌喂氧化魚油、正常魚油的黃顙魚為試驗(yàn)對象, 利用其胃腸道黏膜組織為材料, 提取總RNA, 采用RNA-Seq方法得到轉(zhuǎn)錄組信息; 以轉(zhuǎn)錄組基因信息為基礎(chǔ), 分析了黃顙魚黑色素生物合成途徑、黑色素細(xì)胞分化發(fā)育、黑色素顆粒運(yùn)動(dòng)等代謝過程中的蛋白質(zhì)、酶的基因信息, 以及灌喂氧化魚油、正常魚油后相關(guān)基因的差異表達(dá)信息, 旨在為同類研究、為黃顙魚色素細(xì)胞、黑色素代謝的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

黃顙魚來自于浙江一星集團(tuán)海鹽試驗(yàn)基地, 平均體重(78±1.3) g/尾, 共42尾, 其中, 雌性、雄性個(gè)體各50%。試驗(yàn)魚分別飼養(yǎng)于單體容積0.3 m3的6個(gè)室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖桶中, 每個(gè)養(yǎng)殖桶飼養(yǎng)7尾(雌雄混養(yǎng))。分別設(shè)置魚油組、氧化魚油組, 每組各3個(gè)平行、共6個(gè)養(yǎng)殖桶。用常規(guī)飼料養(yǎng)殖15d后開始灌喂氧化魚油、正常魚油。灌喂期間的水溫(24±1.0)℃、溶解氧7.3 mg/L、pH 7.8。

1.2 氧化魚油

魚油為“高美牌”精煉魚油, 氧化魚油按照實(shí)驗(yàn)室建立的方法制備, 魚油、氧化魚油于-20℃保存?zhèn)溆?。魚油、氧化魚油和魚漿的氧化程度評(píng)價(jià)指標(biāo)見表 1。

由表 1可知, 魚油經(jīng)過氧化后, 過氧化值增加了21.40倍、酸價(jià)增加了3.73倍、丙二醛增加了13.85倍。采用氣相色譜儀, 按照歸一法測定、計(jì)算得到魚油、氧化魚油的EPA+DHA含量分別為25.35%和7.62%, 經(jīng)氧化后, EPA+DHA含量下降了70%。

魚漿按照吳代武等[5]方法制備, 魚漿含水分76.08%、蛋白質(zhì)17.71%、脂肪3.31%、灰分2.86%。采用液相色譜儀測定魚漿含生物胺含量,結(jié)果為組氨44.6 mg/100 g、尸胺230.3 mg/100 g、腐胺71.3 mg/100 g、精胺60.0 mg/100 g和亞精胺110.8 mg/100 g。

表 1 魚油、氧化魚油和魚漿的氧化程度評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab. 1 Oxidative indexes of fish oil, oxidative fish oil and dissolved fish pulp

1.3 魚油、氧化魚油的灌喂方法

在預(yù)試驗(yàn)中, 將魚油、氧化魚油與大豆磷脂(食用級(jí))分別按照將1鯰1比例混合、乳化后灌喂, 發(fā)現(xiàn)黃顙魚出現(xiàn)嘔吐(吐料)情況, 而用實(shí)驗(yàn)室制備的魚漿灌喂則未出現(xiàn)嘔吐(吐料), 經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)按照下述方法制備灌喂用的氧化魚油、魚油。

魚油、氧化魚油分別與大豆磷脂(食品級(jí))以質(zhì)量比1鯰1比例混合, 攪拌混勻、乳化, 再將經(jīng)乳化后的油脂與魚漿按照1鯰4的質(zhì)量比例混合作為灌喂用的灌喂魚油、灌喂氧化魚油(分別含魚油、氧化魚油20%), 于4℃冰箱中保存。每次按照3d的用量進(jìn)行制備, 以保證灌喂用油脂的新鮮度。

按照實(shí)驗(yàn)室建立的方法[6,7], 于每天上午9:00對試驗(yàn)魚定量灌喂, 連續(xù)灌喂7d。灌喂期間投喂黃顙魚商品飼料。

1.4 RNA樣本采集及總RNA提取

按照葉元土等[6,7]方法, 連續(xù)灌喂7d、最后一次灌喂后24h, 每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)各取3尾、每組共9尾(4尾雌性、5尾雄性個(gè)體)用于總RNA提取。

魚體表經(jīng)75%酒精消毒, 常規(guī)解剖, 快速用解剖刀刮取胃和腸道黏膜, 將每尾魚的胃和腸道黏膜混合后, 液氮速凍, 于-80℃保存?zhèn)溆?。采樣所用解剖工具均?jīng)滅酶、滅菌處理。

魚油、氧化魚油組胃腸道黏膜各9個(gè)樣本, 分別用試劑盒(EASYspin Plus)獨(dú)立用于提取總RNA,電泳檢測RNA質(zhì)量。魚油組、氧化魚油組分別選取電泳條帶亮度高、清晰、無拖尾的高質(zhì)量RNA進(jìn)行等量混合為魚油組、氧化魚油組各1個(gè)樣本(每個(gè)樣本至少有5尾試驗(yàn)魚的總RNA樣本組成),RNA質(zhì)量約4 μg。同樣方法再混合一個(gè)RNA樣本,其余的RNA舍棄。魚油組、氧化魚油組分別得到2個(gè)平行樣本用于RNA-seq。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析方法

RNA-Seq樣品總RNA用DNaseⅠ消化DNA后, 用Oligo d (T)磁珠純化總RNA中的mRNA, 向得到的mRNA中加入適量打斷試劑, 在高溫條件下使其片斷化, 再以片斷后的RNA為模板, 合成cDNA,經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測序接頭后, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus-Real-Time PCR System質(zhì)檢和測序, 濾除含N比例大于10%、低質(zhì)量(質(zhì)量值中位數(shù)Q≤25的堿基位點(diǎn))讀段, 得到過濾后的讀段(clean reads)。讀段長度125 bp。

無參轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄本拼接經(jīng)過質(zhì)控(QC)、過濾后得到的讀段(Clean reads), 用Trinity (版本:v2012-10-05, min_kmer_cov為2)軟件進(jìn)行無參考基因組的轉(zhuǎn)錄本拼接[11]。拼接得到266011個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

基因功能注釋與分類對拼接好的轉(zhuǎn)錄本利用不同的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行unigene基因注釋。各數(shù)據(jù)庫及功能注釋所用到的軟件及方法: ①與Swiss-Prot、KOG、KEGG GENES序列數(shù)據(jù)庫的比對采用NCBI blast 2.2.27+。②PFAM蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用HMMER 3.0 package, hmmscan。③GO功能注釋為基于Swissprot和Pfam兩部分的蛋白注釋結(jié)果, 軟件為Blast2GO v2.5。④KEGG相關(guān)注釋為KOBAS。經(jīng)過Swiss-Prot、KO、GO、KOG、PFAM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋, 得到190231個(gè)注釋功能的基因。將注釋得到的單一基因序列, 利用NCBI/Blast進(jìn)行相對于不同物種相同基因的同源性分析。

1.6 基因差異表達(dá)分析

以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列, 采用RSEM軟件(Mismatch 2), 將每個(gè)樣品的clean reads對參考序列做比對, 進(jìn)行基因表達(dá)定量。將灌喂氧化魚油的黃顙魚胃腸道黏膜轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量與灌喂魚油得到的對應(yīng)基因表達(dá)量對比, 進(jìn)行差異表達(dá)分析。差異表達(dá)分析用edgeR軟件包進(jìn)行分析。對于所有基因, 當(dāng)其表達(dá)量在2個(gè)不同樣品間具有差異且統(tǒng)計(jì)分析中調(diào)整P值(假陽性率)＜0.05時(shí), 認(rèn)為其在2個(gè)不同樣品中具有顯著差異表達(dá)。

log2(OFH/FH)為灌喂氧化魚油的黃顙魚胃腸道黏膜某一個(gè)基因表達(dá)量與灌喂正常魚油胃腸道黏膜相同基因表達(dá)量比值以2為底的對數(shù)值, 數(shù)值為正值表達(dá)差異表達(dá)上調(diào)、負(fù)值則為差異表達(dá)下調(diào), 數(shù)值絕對值越大表示差異越大, 當(dāng)≥2或≤-2時(shí),視為差異表達(dá)顯著。

2 結(jié)果

2.1 黑色素生物合成途徑和黑素體運(yùn)動(dòng)蛋白基因的差異表達(dá)

黑色素是在黑色素細(xì)胞內(nèi)以酪氨酸為底物, 經(jīng)歷了L-多巴、多巴醌、多巴素等中間產(chǎn)物, 最后合成黑色素、真黑色素、退黑色素(圖1)。黑色素在黑色素細(xì)胞內(nèi)聚集, 形成黑素體, 黑素體是黑色素在黑色素細(xì)胞內(nèi)的存在形式。將轉(zhuǎn)錄組中涉及黑色素合成途徑和黑素體運(yùn)動(dòng)的酶、蛋白的基因信息統(tǒng)計(jì)在表 2中。

在表 2中, 涉及黑色素合成有4個(gè)基因, 涉及黑素體運(yùn)動(dòng)的有3個(gè)基因。黑色素合成的酪氨酸酶基因與華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)酪氨酸酶基因的同源性為49%, 而其他基因與鮭、鯉、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鲙種類的相同基因的同源性為74%—97%, 具有較高的同源性。

在本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中, 經(jīng)過單一基因注釋和灌喂氧化魚油、正常魚油基因表達(dá)差異分析, 涉及黑色素生物合成的酶注釋得到了酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)、D-多巴色素互變酶-A (DDT-a)共4個(gè)酶蛋白的基因, 且經(jīng)過基因表達(dá)差異分析, 這4個(gè)酶蛋白的log2(OFH/FH)值分別為-6.00、-5.70、8.46和-2.00, 均達(dá)到差異表達(dá)顯著性水平, 顯示灌喂氧化魚油后, 導(dǎo)致黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素合成受到顯著性的影響。

圖1 黑色素合成途徑及其催化的酶、蛋白定位框架圖Fig. 1 Melanin synthesis pathway, its enzyme and protein in localization framework map

涉及黑素體運(yùn)動(dòng)的有3個(gè)主要蛋白質(zhì)基因被注釋, 分別是Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab的27A (Rab27a)、非常規(guī)肌球蛋白-Va (Myosin-Va)、肌球蛋白VIIa-和RAB-相互作用蛋白(MYRIP), log2(OFH/FH)值均未達(dá)到差異表達(dá)顯著性水平, 顯示灌喂氧化魚油對黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑素體運(yùn)動(dòng)的蛋白基因表達(dá)沒有顯著性的影響。

2.2 α-MSH促進(jìn)黑色素合成、黑色素細(xì)胞發(fā)育途徑基因

α-黑素細(xì)胞刺激素(Melanocyte-stimulating hormone-α, α-MSH)是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素, 通過其受體MC-R等參與對黑色素合成途徑、黑色素細(xì)胞的發(fā)育和黑色素細(xì)胞的遷移等生理代謝的調(diào)控作用?？偨Y(jié)涉及α-MSH對黑色素細(xì)胞發(fā)育、黑色素合成的蛋白基因信息見表 3, 共10個(gè)基因。經(jīng)過基因的同源性分析, 這些基因與斑點(diǎn)叉尾鲙、鯉、鯽魚、斑馬魚物種相同基因的同源性為68%—100%,具有較高的同源性。在表 3中, 得到阿黑皮素原(POMC)和阿黑皮素原-2(POMC-2)蛋白基因, 其log2(OFH/FH)值分別為2.40、-5.58, 差異表達(dá)顯著。得到黑色素濃縮激素受體1、2、3(MCH-R1、MCH-R2、MC-R3)三種受體, 以及MCH-R1相互作用的鋅指蛋白(MCH-R1-i), 它們的log2(OFH/FH)值分別為0.00、3.04、5.80和-0.50, 顯示只有MCHR2、MC-R3達(dá)到差異表達(dá)顯著性水平。

在黑色素合成和黑色素細(xì)胞分化和發(fā)育中, 具有關(guān)鍵性調(diào)控作用的小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的log2(OFH/FH)值為-0.30, 顯示灌喂氧化魚油后MITF基因表達(dá)有下調(diào)的趨勢, 但未達(dá)到顯著性水平。

在不同的調(diào)控控制途徑和信號(hào)途徑中, 配對盒蛋白PAX-3 (PAX3)與配對域轉(zhuǎn)錄因子PAX3-A(PAX3-a)、轉(zhuǎn)錄因子SOX-10(SOX10)得到注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-1.40、5.00和-7.14, 顯示灌喂氧化魚油后,PAX3-a差異表達(dá)顯著性上調(diào),而SOX10則差異表達(dá)顯著性下調(diào),PAX3有下調(diào)的趨勢, 但未達(dá)到顯著性水平。

上述結(jié)果表明, 黃顙魚胃腸道黏膜中存在α-MSH及其受體MCH-R1、MCH-R2、MC-R3基因的表達(dá), 其中,MCH-R2、MC-R3差異表達(dá)顯著性上調(diào), 而MCH-R1未顯示差異表達(dá)。在黑色素合成、黑色素細(xì)胞分化、發(fā)育中具有關(guān)鍵性作用的MITF基因有差異表達(dá)下調(diào)的趨勢。對MITF轉(zhuǎn)錄其調(diào)控的SOX10、PAX3、PAX3-a的表達(dá)也受到影響,顯示差異表達(dá)。

表 2 黃顙魚黑色素合成與黑素體在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)的基因信息Tab. 2 Genes associated with melanin synthesis and cellular melanosome movement

2.3 調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑色素細(xì)胞的三個(gè)信號(hào)途徑基因

調(diào)控神經(jīng)嵴干細(xì)胞分化為前黑色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞發(fā)育的信號(hào)途徑主要有KIT及其配體KITL信號(hào)通路、WNT/β-catenin信號(hào)通路、EDN3和EDNRB信號(hào)通路, 依據(jù)轉(zhuǎn)錄組單一基因注釋、KEGG通路注釋、GO功能注釋等結(jié)果, 總結(jié)涉及上述3個(gè)信號(hào)通路的相關(guān)蛋白基因信息見表 4, 共有15個(gè)基因。經(jīng)過基因的同源性分析, 這15個(gè)基因與鯉、斑點(diǎn)叉尾鲙、金線鲃、鯽等物質(zhì)相同基因的同源性為91%—100%, 具有很高的基因同源性。

由表 4可知, 在KIT及其配體KITL信號(hào)通路中,注釋得到原癌基因Kit配體(KITL)、肥大/干細(xì)胞生長因子受體(KITA或SCFR), 其log2(OFH/FH)值分別為-0.35、0.21, 有差異表達(dá), 但均不顯著。對于WNT/β-catenin信號(hào)通路, 注釋得到β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)、淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子1/T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子1-α(LEF-1/TCF1-α)、環(huán)AMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1(CREB-1)基因, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-0.10、-0.99和0.10, 有差異表達(dá)但未達(dá)到顯著性水平。關(guān)于EDN3和EDNRB信號(hào)通路, 注釋得到內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素-2(ET-2)、內(nèi)皮素-1受體(EDNRA)、內(nèi)皮素B受體(EDNRB)基因, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.71、4.37、0.83和-0.20,其中,ET-1和ET-2基因差異表達(dá)達(dá)到顯著性水平。

在涉及的3個(gè)信號(hào)通路中, 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的主要蛋白基因注釋結(jié)果見表 4。主要有Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白的Rho (RHOU)、RHOGTP酶激活蛋白32 Rho (ARHGAP32)、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的α鏈(CaMKⅡ)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α(PRKACA)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位β(PRKACB)、cAMP依賴性蛋白激酶II型-α調(diào)節(jié)亞基(PRKAR2A)得到注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為4.64、-0.80、-6.50、0.58、0.39和-0.69, 其中,RHOU、CaMKⅡ差異表達(dá)顯著, 其余的有差異表達(dá)但不顯著。

表 3 α-MSH對黑色素細(xì)胞發(fā)育、黑色素合成的蛋白基因Tab. 3 Effects of α-MSH pathway genes on the development of the melanocyte and melanin synthesis

表 4 調(diào)控黑色素細(xì)胞分化和發(fā)育的3個(gè)信號(hào)通路的基因Tab. 4 Genes in three signaling pathways modulate melanocyte differentiation and development

3 討論

魚類體色的形成與體色變化受到體內(nèi)因素和環(huán)境因素的多重影響, 本文主要反映了灌胃氧化魚油后, 涉及黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素細(xì)胞分化和發(fā)育、黑色素生物合成、黑素體在黑色素細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)的有關(guān)酶和蛋白質(zhì)的基因的差異表達(dá)信息。成熟的黑色素細(xì)胞數(shù)量和密度、黑色素細(xì)胞中黑色素的數(shù)量、黑色素細(xì)胞中黑素體的運(yùn)動(dòng)與分布狀態(tài)等是魚體黑色體色的形成、黑色體色變化的生物學(xué)基礎(chǔ), 而這些生理過程是在嚴(yán)格的生理環(huán)境、基因表達(dá)調(diào)控等作用下進(jìn)行的[1,2]。

3.1 黑色素的生物合成途徑

黑色素是在黑色素細(xì)胞內(nèi), 以酪氨酸為原料,在系列酶和蛋白質(zhì)作用下、經(jīng)過系列反應(yīng)過程而合成?？偨Y(jié)黑色素合成途徑、并將控制代謝反應(yīng)的酶和蛋白定位于合成途徑之中, 涉及代謝反應(yīng)的酶或蛋白質(zhì), 及其log2(OFH/FH)值用斜體、加粗標(biāo)示(圖1)。

深度學(xué)習(xí)發(fā)生與否的重要特征不僅僅是促進(jìn)生活經(jīng)驗(yàn)與所學(xué)知識(shí)相互轉(zhuǎn)化，還更應(yīng)當(dāng)讓學(xué)生能夠主動(dòng)地內(nèi)化吸收知識(shí)，培養(yǎng)其將所學(xué)知識(shí)轉(zhuǎn)化為社會(huì)實(shí)踐的能力。除了深度學(xué)習(xí)對實(shí)踐與應(yīng)用的要求很高，其實(shí)在面向社會(huì)生產(chǎn)生活與未來社會(huì)的要求下，培養(yǎng)的學(xué)生是否具備將所學(xué)知識(shí)轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的實(shí)踐能力已經(jīng)成為了個(gè)人、社會(huì)乃至國家發(fā)展的關(guān)鍵所在。筆者在經(jīng)過多次的教學(xué)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)： 將學(xué)生所學(xué)的知識(shí)在復(fù)習(xí)課中按照一定的社會(huì)情境問題組成探究化主線進(jìn)行教學(xué)，讓學(xué)生在解決實(shí)際生產(chǎn)問題中不斷探究、逐層深入，該過程就可以讓學(xué)生根據(jù)所學(xué)知識(shí)不斷解決生產(chǎn)實(shí)踐的相關(guān)問題。

黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素合成代謝反應(yīng)鏈的關(guān)鍵酶是酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR), 控制了反應(yīng)鏈的代謝速度, 是限速酶。由圖1可知, 酪氨酸酶主要參與2個(gè)反應(yīng)過程: 催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴、氧化L-多巴形成多巴醌, 多巴醌經(jīng)一系列反應(yīng)后形成黑色素; 在5,6-二羥基吲哚轉(zhuǎn)化為吲哚5,6-醌(Indole5,6-quinone)的過程中, 也是受到酪氨酸酶的催化作用。酪氨酸酶的催化作用還需要2個(gè)重要蛋白的參與, 即酪氨酸酶相關(guān)蛋白1和2(TRP-1、TRP-2), 酪氨酸酶相關(guān)蛋白2又稱為L-多巴色素互變異構(gòu)酶(L-dopachrome tautomerase, DCT), 在多巴醌(DOPA quinone)轉(zhuǎn)化為吲哚5,6-醌-2-羧酸(Indole 5,6-quinone carboxylic acid)、多巴色素(DOPA chrome)轉(zhuǎn)化為5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)的反應(yīng)中發(fā)揮作用, 同時(shí)該步反應(yīng)還有D-多巴色素互變酶-A (D-dopachrome tautomerase-A, DDT-A)的參與。在本試驗(yàn)中, 在黃顙魚胃腸道黏膜轉(zhuǎn)錄組中,注釋得到了上述酶和蛋白質(zhì)的基因信息; 差異表達(dá)分析結(jié)果顯示, 灌喂氧化魚油后, 酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP1)的log2(OFH/FH)值分別為-6.00、-5.70, 均是差異表達(dá)顯著下調(diào); 而酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP2)的log2(OFH/FH)值為8.40, 則是差異表達(dá)顯著上調(diào), 由于TRP2同時(shí)還具有L-多巴色素互變異構(gòu)酶的作用, 因此, 在灌喂氧化魚油后,黃顙魚胃腸道黏膜黑色素細(xì)胞中黑色素的生物合成代謝受到顯著性的影響, 酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1的基因表達(dá)是顯著下調(diào)的。在多巴色素互變構(gòu)型變化調(diào)節(jié)反應(yīng)中, L-多巴色素互變異構(gòu)酶蛋白基因表達(dá)是顯著上調(diào)、而D-多巴色素互變酶-A蛋白基因差異表達(dá)是顯著下調(diào)。

包括黃顙魚在內(nèi)的淡水魚類, 酪氨酸酶在皮膚、鱗片、血清中均有分布, 且酪氨酸酶活力大小與魚體體表黑色顏色的深淺直接成正相關(guān)關(guān)系、在不同部位酪氨酸酶活力大小與魚體黑色素合成部位有關(guān)[1,8]。從圖1的代謝途徑以及相關(guān)酶蛋白在代謝鏈中的定位結(jié)果看, 可以發(fā)現(xiàn): 在灌喂氧化魚油急性損傷后, 黃顙魚胃腸道黑色素細(xì)胞合成黑色素的代謝限速反應(yīng)階段是代謝下調(diào)的, 而由L-多巴醌、多巴色素異構(gòu)化為真黑色素的反應(yīng)過程則是上調(diào)的、D多巴醌異構(gòu)化為真黑色素的反應(yīng)過程則是上調(diào)的[DCT的log2(OFH/FH)值為8.40]。結(jié)果表明, 在灌喂氧化魚油的條件下, 黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素生物合成代謝關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)顯著下調(diào)、黑色素的合成可能受到顯著性的抑制作用。同時(shí), 即使在黑色素合成反應(yīng)受到下調(diào)影響的情況下, 還是可以將L-多巴醌、多巴色素更多地異構(gòu)化為真黑色素, 而D-多巴醌異構(gòu)化為真黑色素的反應(yīng)是下調(diào)[DDT的log2(OFH/FH)值為-2.00]。這或許也是一種生理適應(yīng)性反應(yīng)。

3.2 黑素體運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白基因差異表達(dá)

黑色素細(xì)胞是一類樹突狀的細(xì)胞, 細(xì)胞有很多的樹突狀枝突, 黑色素合成后形成黑素體。當(dāng)黑素體在黑色素細(xì)胞中央部分集中、枝突中缺少黑素體時(shí), 魚體的體色變淺; 當(dāng)黑素體從細(xì)胞中央運(yùn)輸?shù)街ν恢性谥ν恢械姆植济芏仍龃髸r(shí), 魚體的體色加深、為深黑色體色[1,2]。

黑素體在黑色素細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸主要是沿著微管且以微管形成或解體作為動(dòng)力。有兩類微管蛋白:驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)和細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白(Cyto-plasmic-dynein)參與黑素體的運(yùn)輸。有資料表明[2,9], 黑素體依賴Rab27a (Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-27)、非常規(guī)肌球蛋白-VA (Myosin-Va)、肌球蛋白VIIa-和RAB-相互作用蛋白(Melanophilin)結(jié)合于微管蛋白上、并依賴驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白的活動(dòng)實(shí)現(xiàn)黑素體在黑色素細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng), 且這種運(yùn)動(dòng)是雙向的: 由細(xì)胞核周圍向樹突狀分枝運(yùn)輸、由樹突狀分枝向細(xì)胞核周圍運(yùn)輸。Rab27a是一種組織特異性蛋白, 活性形式GTP-Rab27a連接到黑素小體膜上, 通過與Myosin-Va相互作用將黑素體連接到肌球蛋白-Va上。因此, Rab27a、Myosin-Va、Melanophilin是黑素體與微管結(jié)合并在微管上運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵性蛋白。在灌喂氧化魚油后, 它們的的log2(OFH/FH)值分別為0.89、-0.80和0.10三種蛋白基因有差異表達(dá), 但不顯著, 表明在灌喂氧化魚油造成急性損傷后, 雖然黃顙魚黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素的生物合成有顯著性的變化, 但細(xì)胞內(nèi)黑素體運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白表達(dá)活性沒有顯著性的變化。

3.3 α-MSH和3個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路對黑色素細(xì)胞分化、發(fā)育的調(diào)控作用

黑色素細(xì)胞數(shù)量的增加不是細(xì)胞有絲分裂增殖, 而是由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化發(fā)育而來[2,3]。神經(jīng)嵴是脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育過程中出現(xiàn)的暫時(shí)性結(jié)構(gòu), 神經(jīng)嵴干細(xì)胞就是由神經(jīng)板邊緣區(qū)域的細(xì)胞發(fā)育來的。由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑色素細(xì)胞, 大致經(jīng)歷了神經(jīng)嵴細(xì)胞、成黑色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞3個(gè)階段, 在黑色素細(xì)胞分化、發(fā)育過程中, 同時(shí)進(jìn)行著黑色素的合成、黑素體的運(yùn)動(dòng)。

神經(jīng)嵴細(xì)胞具有多向分化的潛能性和遷移性,是一類具有多種分化潛能的干細(xì)胞, 從神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育為成熟的黑色素細(xì)胞是其分化潛能之一。由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化發(fā)育為黑色素細(xì)胞要經(jīng)歷復(fù)雜的細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞定向增殖和發(fā)育等過程,其發(fā)育過程是受到細(xì)胞外部環(huán)境和嚴(yán)格的基因表達(dá)編排共同發(fā)揮作用、且相互影響的復(fù)雜結(jié)果, 同樣也受到基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控, 這個(gè)過程中的信號(hào)通路主要包括: 黑色素合成激素α-MSH的調(diào)控和3個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路WNT/β-catenin信號(hào)通路、EDN3和EDNRB信號(hào)通路、KIT及其配體KITL信號(hào)通路[2,10,11]。

α黑素細(xì)胞刺激激素(α-Melanocyte stimulating hormone, α-MSH)是4種黑素細(xì)胞刺激素(Melanocyte-stimulating hormone, MSH)的一種, 屬于神經(jīng)內(nèi)分泌激素, 含有13個(gè)氨基酸殘基, 其前體為阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin, POMC)。POMC可在腦垂體、下丘腦及神經(jīng)系統(tǒng)其他部位、胃腸道和皮膚中產(chǎn)生[13]。POMC水解成ACTH (促腎上腺皮質(zhì)激素adreno-cortico-tropic-hormone)、β-促脂解素、β-內(nèi)啡肽和γ-MSH, ACTH在酶的作用下可繼續(xù)降解為α-MSH, α-MSH就是ACTH分子的l—13氨基酸組成。α-MSH的生理作用是直接激活其受體MC-1R, 使黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的表達(dá)增加、活性增強(qiáng), 從而使黑素合成量增加; α-MSH還通過影響黑素細(xì)胞的增生、樹突形成、對黑素細(xì)胞的免疫保護(hù)作用等。在本試驗(yàn)中, 注釋得到阿黑皮素原(Proopiomelanocortin, POMC)和阿黑皮素原-2(Proopiomelanocortin-2, POMC-2)2種α-MSH前體, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.40、-5.58, 前者差異表達(dá)顯著上調(diào), 而后者差異表達(dá)顯著下調(diào)。α-MSH的3種受體MCH-R1、MCH-R2、MC-R3得到成功的注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別0.00、3.04和5.80, 顯示MCH-R2、MC-R3差異表達(dá)顯著上調(diào)。這個(gè)結(jié)果顯示, 在黃顙魚胃腸道黏膜中也存在α-MSH調(diào)控途徑, 其主要基因的差異表達(dá)受到灌喂氧化魚油的顯著影響, 體現(xiàn)在α-MSH前體POMC、POMC-2的表達(dá)活性顯著性變化, α-MSH的受體MCH-R2、MC-R3差異表達(dá)顯著上調(diào)。

WNT信號(hào)通路在神經(jīng)嵴干細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段都能發(fā)揮作用, 也包括神經(jīng)嵴肝細(xì)胞分化為黑色素細(xì)胞的分化和發(fā)育過程。作用途徑首先是通過活化其受體Frizzled, 隨后激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子, 如β-catenin、PKC、CAMKII、PKA和Rho GTPase等, 然后啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜反應(yīng)。在本試驗(yàn)中,β-Catenin、LEF-1/TCF1-α、CREB-1在黃顙魚胃腸道黏膜中被注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-0.10、-0.99和0.10, 有差異表達(dá)但未達(dá)到顯著性水平。

EDN3和EDNRB信號(hào)通路。EDN3為內(nèi)皮素-3endothelin 3, EDNRB為內(nèi)皮素受體B, EDNRB與EDN3結(jié)合, 活化下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PKC、CamK II和MAPK, 繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生理應(yīng)答, 該信號(hào)通路對于神經(jīng)嵴來源的黑色素細(xì)胞和腸神經(jīng)節(jié)的發(fā)育是非常重要的, 對于黑色素細(xì)胞發(fā)育分化所需的Tyr酶表達(dá)起至關(guān)重要作用。注釋到EDNRA、EDNRB二種受體, 它們的log2(OFH/FH)值分別為0.83和-0.20; 同時(shí),ET-1、ET-2基因也被注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.71和4.37, 差異表達(dá)顯著性上調(diào)。

上述結(jié)果顯示, 黃顙魚被灌喂氧化魚油后, 在胃腸道黏膜中, 黑色素合成激素α-MSH前體的基因、α-MSH受體MCH-R2、MC-R3差異表達(dá)顯著上調(diào); WNT/β-catenin信號(hào)通路、EDN3和EDNRB信號(hào)通路、KIT及其配體KITL信號(hào)通路的有關(guān)基因受到灌喂氧化魚油的影響有差異表達(dá), 但未達(dá)到顯著性水平。是否可以認(rèn)為, 黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素細(xì)胞分化與發(fā)育受α-MSH通路的影響較大, 即受到激素調(diào)控的影響更大, 而受其他3個(gè)信號(hào)通路的影響較??？這需要進(jìn)一步的研究。

3.4 黑色素代謝和黑色素細(xì)胞發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵性基因的差異表達(dá)分析

從圖2可見, 不同的信號(hào)通路通過對CREB、PAX3和PAX3-a、SOX10等靶基因的調(diào)控, 調(diào)節(jié)MITF的表達(dá)活性, 再對下游的TYR、TRP-1和TRP-2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控, 從而實(shí)現(xiàn)對黑色素生物合成、黑素體在黑色素細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)、對黑色素細(xì)胞的分化和發(fā)育的調(diào)控作用。

SOX10是轉(zhuǎn)錄因子中High-mobility group-domain SOX家族成員,SOX10基因在黑色素細(xì)胞形成過程中也發(fā)揮著重要作用, 它調(diào)控MITF基因的表達(dá)從而調(diào)控黑色素的遷移和分化[13,14]。SOX10基因還可調(diào)控黑色素合成途徑的L-多巴色素互變異構(gòu)酶(DCT)又稱為酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP-2)基因的表達(dá)。SOX10受到EDN3-EDNRB信號(hào)通路的調(diào)控,同樣也受到WNT/β-catenin信號(hào)通路的影響[15]。在本試驗(yàn)中,SOX10的log2(OFH/FH)值為-7.14, 為差異表達(dá)顯著性下調(diào);DCT的log2(OFH/FH)值為8.40,為差異表達(dá)顯著性上調(diào)。這表明SOX10的表達(dá)受到灌喂氧化魚油的影響很大, 雖然導(dǎo)致對其下游基因如Miitf基因的表達(dá)受到顯著影響, 但L-多巴色素的異構(gòu)化是增強(qiáng)的。

PAX3和SOX10協(xié)同作用激活MITF啟動(dòng)子, 激活MITF的表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)黑色素合成關(guān)鍵酶如TRP-1、TRY、DCT等的表達(dá)增加[15]。在本試驗(yàn)中,PAX3的log2(OFH/FH)值為-1.40;SOX10的log2(OFH/FH)值為-7.14, 都是差異表達(dá)下調(diào), 顯示對其下游基因的調(diào)控作用下降, 會(huì)影響到黑色素的生物合成, 是黑色素生物合成量呈現(xiàn)下降趨勢。

MITF作為色素細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的一個(gè)信號(hào)分子, 介導(dǎo)了多種信號(hào)級(jí)聯(lián)過程, 在色素細(xì)胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵性作用, 因此它可以作為關(guān)鍵性靶位, 用于研究其他相關(guān)基因[16]。MITF可調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá), 從而參與黑色素細(xì)胞中黑色素生成的調(diào)控。在本試驗(yàn)中,MITF的log2(OFH/FH)值為-0.30, 為差異表達(dá)下調(diào)。

圖2 黃顙魚黑色素細(xì)胞分化與發(fā)育過程中的激素與信號(hào)通路基因網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Gene network of hormone and signaling pathways during melanoma cell differentiation and development process

從上述幾個(gè)關(guān)鍵基因的差異表達(dá)結(jié)果看, 黃顙魚在灌喂氧化魚油后, 其胃腸道黏膜組織中, 涉及黑色素細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟, 以及涉及黑色素生物合成、黑素體在黑色素細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的主要基因顯示差異表達(dá), 總體上是差異表達(dá)下調(diào)的趨勢, 而涉及L-多巴色素的異構(gòu)化的反應(yīng)是增強(qiáng)的。因此,可以認(rèn)為, 灌喂氧化魚油對黑色素細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟, 以及黑色素的生物合成、黑素體運(yùn)動(dòng)等的影響是負(fù)面的, 可能導(dǎo)致成熟的黑色素細(xì)胞數(shù)量不足、皮膚中成熟的黑色素細(xì)胞密度下降、黑色素?cái)?shù)量下降, 導(dǎo)致黃顙魚黑色體色變化, 黑色體色不足, 而出現(xiàn)體色變淺的情況; 同時(shí), 由于黃顙魚能夠吸收、并沉積飼料來源的黃色素, 在黑色素、黑色體色不足的情況下, 魚體出現(xiàn)黃色體色。

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