豬圓環(huán)病毒2型與豬鏈球菌混合感染的診治

楊年信，李幫林，向 輝，張惠明，楊克禮

（1.湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣畜牧獸醫(yī)局，湖北 鶴峰 445800；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064）

豬圓環(huán)病毒（Porcine cirovirus，PCV）是近年來(lái)危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，根據(jù)其基因組不同分為豬圓環(huán)病毒l型（Porcine cirovirus type l，PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（Porcine cirovirus type l，PCV2）[1]。PCV1對(duì)動(dòng)物沒(méi)有致病作用，PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原。該病多以5～12周齡的仔豬發(fā)病率較高，主要臨床表現(xiàn)為呼吸困難、貧血、進(jìn)行性消瘦、生長(zhǎng)遲緩、偶有黃疽和腹瀉等[2-3]。

豬鏈球菌?。⊿.suis）是由鏈球菌引起豬的一種急性、敗血癥型和腦膜炎型的人畜共患傳染病[4]。按照莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為35個(gè)血清型，引起豬和人發(fā)病的有1、2、9、7和8等血清型，以2型豬鏈球菌為主[5-6]。急性主要表現(xiàn)為敗血癥，一般未出現(xiàn)癥狀即死亡[7]，慢性主要表現(xiàn)為跛行、關(guān)節(jié)腫大或麻木，耳后、腹下、肛門(mén)周?chē)l(fā)紅，有出血點(diǎn)等[6]。哺乳仔豬發(fā)病主要以敗血癥型、腦膜炎型為主，發(fā)病率和死亡率均較高；肥育豬發(fā)病多以關(guān)節(jié)炎或淋巴結(jié)膿腫為特征，死亡率較低，但影響其生長(zhǎng)發(fā)育[9]。

2017年3月，鶴峰某豬場(chǎng)的豬只先后大量發(fā)病，各階段的豬均有發(fā)病和死亡，持續(xù)近40 d，經(jīng)濟(jì)損失較大。筆者將豬場(chǎng)送檢的病料送至湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定和PCR檢測(cè)，診斷為PCV2和豬鏈球菌的混合感染。根據(jù)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，筆者提出了綜合防控技術(shù)方案，經(jīng)實(shí)施后，疫情得到了有效控制。

1 材料與方法

1.1主要試劑M-肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基以及其他生化培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker等，均購(gòu)自TaKaRa公司；PCV2檢測(cè)引物由上海San-gon生物工程公司合成。

1.2樣品處理對(duì)無(wú)菌采取的病料組織直接涂到載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，無(wú)菌采集急性死亡病豬肺、脾及淋巴結(jié)等組織，制作抹片，經(jīng)干燥、火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.3細(xì)菌分離培養(yǎng)于超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)取肺、脾及淋巴結(jié)等病料直接接種于鮮血瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，符合豬鏈球菌的形態(tài)和溶血特征后，再挑取典型菌落接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基和普通肉湯培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24～48 h，革蘭氏染色、鏡檢，并做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)。

1.4病毒核酸的提取將病料組織與DMEM溶液按1:5混合，充分勻漿，-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，立即提取核酸或置-80℃保存?zhèn)溆?。病毒核酸的提取利用病毒DNA/RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 P C V 2 P C R擴(kuò)增取提取的DNA，使用針對(duì)PCV2 ORF2基因設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物PCV2-F：5’-CGAGCTCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’，下游引物PCV2-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG-3’，產(chǎn)物預(yù)期大小約720 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mm）1 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，Taq酶0.25 μL（5 U/μL），加滅菌超純水至25 μL；PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃變性5 min，按94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外觀測(cè)儀下觀察記錄結(jié)果。

1.6防控措施全場(chǎng)封群，全面消毒：在疫情期間，嚴(yán)禁生產(chǎn)區(qū)工作人員出入，飼養(yǎng)員和各類(lèi)用具嚴(yán)禁串舍。出入豬場(chǎng)的車(chē)輛要進(jìn)行嚴(yán)格消毒。舍外場(chǎng)地和豬舍空欄用2%～3%的燒堿溶液噴灑消毒。豬舍內(nèi)每3 d用消毒水帶豬消毒1次，走廊和過(guò)道用福爾馬林液每3 d消毒1次。

緊急接種：對(duì)無(wú)明顯癥狀的豬只，分別緊急免疫自制苗2～4 mL。

對(duì)癥治療：對(duì)出現(xiàn)繼發(fā)感染的豬只，應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行治療，如環(huán)丙沙星、頭孢類(lèi)藥物等；對(duì)呼吸困難的豬只使用止咳平喘藥物，如麻黃堿、氨茶堿等；對(duì)高熱豬只使用退燒藥物，如安乃近、氨基比林等。

輔助治療：豬圓環(huán)病毒為病毒性疫病，使用抗生素治療無(wú)效，只能對(duì)癥治療并控制繼發(fā)感染。建議配合使用病毒靈、干擾素、免疫球蛋白、高免血清等廣譜抗病毒的藥物進(jìn)行輔助治療，同時(shí)可配合并使用甘草合劑、黃芪多糖等增強(qiáng)免疫力的藥物。

2 結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀及剖檢病理變化臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱，食欲下降，呼吸困難、咳嗽，部分病豬皮膚發(fā)紅，部分病豬皮膚蒼白，部分母豬流產(chǎn)，部分仔豬有關(guān)節(jié)炎而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，后肢不能站立；個(gè)別豬突然發(fā)病，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，仔豬和母豬均有死亡。剖檢病變主要表現(xiàn)為肺臟有大面積的出血、水腫，并有局灶性壞死結(jié)節(jié)，呈敗血癥的特殊癥狀；心臟外膜出血嚴(yán)重，腎表面有出血點(diǎn)，脾腫大，淋巴結(jié)腫大；關(guān)節(jié)腔內(nèi)有黃色黏稠液體。

2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定結(jié)果鮮血瓊脂平板上可見(jiàn)灰白色表面光滑濕潤(rùn)、稍微隆起的半透明的小菌落，菌落周?chē)梢?jiàn)約1 mm透明溶血環(huán)，呈典型的β-型溶血（圖1）；在普通瓊脂平板上菌落較小。在血清肉湯培養(yǎng)基中形成均勻渾濁，試管底部有明顯的沉淀，無(wú)菌膜。革蘭氏染色，鏡檢可見(jiàn)大量短鏈狀或長(zhǎng)鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌（圖2）。對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果該菌發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、水楊酸和山梨醇，不發(fā)酵木糖、阿拉伯糖，綜上判定該菌為鏈球菌。

圖1 鮮血瓊脂平板上的菌落Fig.1 Colony on the blood AGAR plate

圖2 顯微鏡下的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌Fig.2 The microphotograph of streptococcus suis

2.3 P C V 2 P C R檢測(cè)結(jié)果以病豬組織中提取的病毒DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的PCV2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果所檢測(cè)的組織樣品全部擴(kuò)增出與預(yù)期產(chǎn)物大小一致的目的條帶，即為PCV2陽(yáng)性（圖3）。

圖3 PCV2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresis of the PCR product of PCV2

綜合以上結(jié)果可知，8份組織樣品檢測(cè)結(jié)果豬圓環(huán)病毒2型均為陽(yáng)性，結(jié)合臨床表現(xiàn)及細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果，判定該豬場(chǎng)本次暴發(fā)的疫情為豬圓環(huán)病毒2型和豬鏈球菌的混合感染所致。

2.4防控效果采用上述綜合防控措施20 d后，該豬場(chǎng)的病情逐步得到控制，40 d后疫情平息，生產(chǎn)秩序恢復(fù)正常并逐步達(dá)到發(fā)病前的水平。

3 討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，PCV2的陽(yáng)性率為100%（8/8），結(jié)合臨床癥狀、剖檢病理變化及細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果，確診該豬場(chǎng)發(fā)生的疫病為PCV2與豬鏈球菌的混合感染。

PCV2可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，使其抵抗力降低，容易引起其他病毒或細(xì)菌的繼發(fā)或并發(fā)感染，從而引起感染豬的大量死亡[10-11]。臨床上，PCV2的混合感染與其他病原體感染所引起的呼吸系統(tǒng)疫病的表現(xiàn)極為相似，并常伴隨其他混合感染或/和繼發(fā)感染。因此，僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀以及剖檢變化很難對(duì)疫病作出正確診斷。PCR方法是當(dāng)前的一種快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，可用于臨床診斷。

由于PCV2是病毒性疫病，臨床上使用常規(guī)的方法控制其混合感染效果很不理想。本研究中使用自制苗進(jìn)行防治，配合注射敏感抗生素、免疫增強(qiáng)劑液等，同時(shí)，采用加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等綜合防控措施，取得了理想的防治效果。自制苗是在無(wú)菌條件下采集病豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織經(jīng)過(guò)甲醛滅活制成的，可用于發(fā)病場(chǎng)或發(fā)病地區(qū)PCV2的防治，但由于安全性等因素尚不能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。臨床使用時(shí)應(yīng)先做安全性試驗(yàn)，若有不良反應(yīng)出現(xiàn)，需立即停止使用[12]。

豬鏈球菌病近年來(lái)發(fā)病率較高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的影響較為嚴(yán)重。該病一年四季均有發(fā)生，飼養(yǎng)環(huán)境差、飼料營(yíng)養(yǎng)失衡、應(yīng)激等因素均可誘發(fā)本病[13]。但很多情況下，鏈球菌可繼發(fā)于其他病原感染之后，如PRRSV感染、PCV2感染等。因?yàn)镻RRSV和PCV2均可以破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制。已有的研究表明，PRRSV和PCV2病毒在豬體內(nèi)可以相互促進(jìn)增殖，混合感染具有明顯的協(xié)同致病作用[14]?；旌细腥臼沟秘i病情復(fù)雜化，給疾病的診治增加了難度，因此對(duì)發(fā)病豬盡早確診、盡早治療，以減少混合感染、繼發(fā)感染病例的發(fā)生。因此，加強(qiáng)對(duì)PCV2和PRRSV的預(yù)防，對(duì)豬場(chǎng)其他疫病的防控有著重要的意義。

無(wú)論是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)，還是農(nóng)村散養(yǎng)戶(hù)，對(duì)于疫病的防控均要貫徹“預(yù)防為主”的方針，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出的原則；同時(shí)保證豬群充足的營(yíng)養(yǎng)，減少應(yīng)激；豬舍保持良好的通風(fēng)和適宜的溫度、濕度；定期消毒，交替使用消毒藥，防止耐藥菌株的產(chǎn)生。只有這樣才能最大限度地減少各類(lèi)疫病的發(fā)生，避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

[1]Hamel AL,Lin LL,Nayar GP.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J].Journal of Virology,1998,72(6):5262-5267.

[2]郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（3）：3-5.

[3]馬莉莉，王宇婷，趙微，等.多殺性巴氏桿菌和豬圓環(huán)病毒混合感染的診斷[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（7）：36-39.

[4]王宇婷，王云光，吳丹丹，等.2007-2015年黑龍江省豬鏈球菌病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（18）：109-111，296.

[5]杜華茂，丁玉春，王麗麗，等.4株豬鏈球菌的病原生物學(xué)特性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：24-28.

[6]馬莉莉，王宇婷，倪宏波.豬圓環(huán)病毒和鏈球菌混合感染的診斷[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2016（10）：37-40.

[7]閔成軍，劉亞彬.豬鏈球菌的致病性[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（S）：257-259.

[8]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].第4版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[9]劉志科，張秋雨，陳創(chuàng)夫.豬鏈球菌病原的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)豬，2017（2）：105-108.

[10]Allan GM,Ellis JA.Porcine circoviruses:A review[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2000,12(1):3-14.

[11]Wellenberg GJ,Stockhofe-zurwieden N,Boersma WJ,et al.The presence of co-infections in pigs with clinical signs of PMWS in the Netherlands:A case-control study[J].Research in Veterinary Science,2004,77(2):177-184.

[12]陳金山，陳俊杰，吳玉蘋(píng)，等.豬圓環(huán)病毒感染組織滅活苗的臨床應(yīng)用效果觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（11）：124-126．

[13]何孔旺，陸承平.豬鏈球菌2型的致病性與毒力因子[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（9)：17-18.

[14]王天戶(hù)，婁忠子，劉思當(dāng).豬PRRSV單獨(dú)感染及與PCV2混合感染的免疫病理學(xué)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（1）：187-190．