遼寧絨山羊多胎基因ESR靶標(biāo)microRNA的篩選

郭 丹，王澤英，張 鵬

（1.遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866）

雌激素能刺激雌性動(dòng)物的副性腺和生殖道，引起第二性征的發(fā)育以及性周期的變化，協(xié)同促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）作用，能使卵泡產(chǎn)生FSH、LH受體[1]。由于雌激素的作用必須通過雌激素受體介導(dǎo)，因此ESR的生物學(xué)作用與雌激素的生物學(xué)作用密切相關(guān)[2]。雌激素受體（ESR）的E區(qū)是雌激素與受體的結(jié)合區(qū)，能影響雌激素基因在雌性動(dòng)物組織的表達(dá)與調(diào)控，從而對繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育發(fā)揮作用[3]。因此，選擇遼寧絨山羊ESR基因位于E區(qū)的外顯子4進(jìn)行研究，有助于直接了解多羔基因的分子機(jī)理，找到多羔基因的特異分子標(biāo)記。

1 試驗(yàn)材料

1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)所需的組織樣和血樣取自遼寧省畜牧科學(xué)研究院提供的遼寧絨山羊。采集10只種母羊的血液保存于加入ACD的血液抗凝管中，存于-70℃冰箱中保存，用于DNA的抽提。

1.2試驗(yàn)藥品DL 2000 DNA Marker：購自大連寶生物工程有限公司；血液DNA提取試劑盒：購自天根生化科技有限公司；PCR試劑2×Taq PCR MasterMix：購自天根生化科技有限公司。

1.3主要儀器設(shè)備超低溫冰箱：NUAIR公司；TC-512型梯度PCR儀：英國TECHNE公司；ChemiDoc XRS數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)：Bio-Rad公司；OYYHZI型、DYY-111-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠；U-1800紫外分光光度計(jì)：HITACHI公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1血液組織DNA的提取室溫解凍血樣，約10 min，取250 μL血樣，利用DNA提取試劑盒進(jìn)行全血DNA的提取。

2.2 DNA濃度和純度的檢測取2 μL待檢DNA溶液和1 μL 6×loading buffer上樣緩沖液混勻，上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳30 min。在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，并拍照保存，以供分析。

2.3引物設(shè)計(jì)在NCBI數(shù)據(jù)庫找到羊ESR基因序列（登錄號為cte-mir-279 MI0010083），利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，再用軟件Oligo 6進(jìn)行引物評估，對3′-UTR設(shè)計(jì)特異引物，由上海生工合成引物。依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行PCR對羊的ESR基因所用引物如表1所示。

2.4基因目的片段的擴(kuò)增本試驗(yàn)采用設(shè)計(jì)的上、下游特異引物，在最適退火溫度條件下獲得ESR基因各個(gè)區(qū)段目的片段。用ESR基因的3′-UTR區(qū)域的基因引物進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)，需要對組織樣提取的DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增。然后根據(jù)PCR方法，將檢測后成功獲得的ESR基因的3′-UTR區(qū)域基因擴(kuò)增產(chǎn)物按1:1比例混勻，將所有成功獲得的ESR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序[4]。測序結(jié)果顯示，3′-UTR區(qū)648 bp處有差異。

表1 ESR基因3′調(diào)控區(qū)目的片段PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR productsPrimers for 3′control region of ESR

2.4.1 配置25 μL體系反應(yīng)液2×Taq PCR Master-Mix 2.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL。

2.4.2 PCR反應(yīng)程序95℃3 min，95℃30 s和54.2℃30 s 30個(gè)循環(huán)，72℃2 min，72℃5 min。

2.5序列測定與S N P（單核苷酸突變）定位擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣后進(jìn)行凝膠試驗(yàn)（1.5%瓊脂糖凝膠），同時(shí)加5 μL Marker作參照，在120 V電壓條件下，電泳30 min左右。電泳結(jié)束后，凝膠成像儀檢測目的條帶后拍照，標(biāo)記，送樣到沈陽生工測序。測序的結(jié)果用DNAMAN 4.0生物軟件進(jìn)行拼接，進(jìn)而得到最終目的序列。將目的序列與GenBank中相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對分析，從而實(shí)現(xiàn)基因的序列結(jié)構(gòu)確定[5]。然后利用DNAStar、DNAMAN 4.0、BLAST等軟件與GenBank中序列進(jìn)行比較分析。

利用數(shù)據(jù)庫和線軟件預(yù)測3′端非翻譯區(qū)序列靶標(biāo)MicroRNA： ①miRBase（http://www.mirbase.org/）MicroRNA預(yù)測。②Online microRNA predection tool（http://132.77.150.113/pubs/mir07/mir07_prediction.html）。 ③ RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）MicroRNA結(jié)構(gòu)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 E S R基因P C R擴(kuò)增產(chǎn)物普通瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

3.2篩選得到的mi- R N A的特點(diǎn)測序后通過基因序列與波峰的比對發(fā)現(xiàn)，在ESR基因3′-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)差異位點(diǎn)，648 bp位點(diǎn)A/T的突變。見圖2和圖3。

3.3microRNA的分離與靶標(biāo)結(jié)合的特點(diǎn)利用在線軟件查找羊的microRNA，羊的靶標(biāo)microRNA庫包含137個(gè)microRNA，用miRBASE軟件將ESR基因與羊的microRNA結(jié)合情況分析后發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變前結(jié)合的microRNA，2個(gè)突變后結(jié)合的microRNA。

3.3.1 突變前結(jié)合的microRNA cte-miR-278 MIMAT0009538， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UCGGUGGGACUUUCGUUCGUUC，通過DNAMAN 4.0生物軟件進(jìn)行序列比對，得出圖4。

圖1 遼寧絨山羊梯度PCR電泳Fig.1 Liaoning cashmere goat gradient PCR electrophoresis

圖2 遼寧絨山羊ESR基因A/T突變前序列Fig.2 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T pre-mutation sequence

圖3 遼寧絨山羊ESR基因A/T突變后序列Fig.3 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T mutation sequence

圖4 遼寧絨山羊突變前序列與cte-miR-278序列比對Fig.4 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence alignment with cte-miR-278 sequence

cte-miR-279 MIMAT0009539，通過Online mi-croRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UGACUAGAUCCACACUCAUCC，通過DNAMAN 4.0生物軟件進(jìn)行序列比對，得出圖5。

3.3.2 突變后結(jié)合的microRNA cte-miR-1992 MIMAT0009700， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UCAGCAGUUGUACCACUGAUGUG，通過DNAMAN 4.0生物軟件進(jìn)行序列比對，得出圖6。

圖5 遼寧絨山羊突變前序列與cte-miR-279序列比對Fig.5 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence and cte-miR-279 sequence alignment

圖6 遼寧絨山羊突變后序列與bta-miR-2355-5p序列比對Fig.6 Alignment of bt-miR-2355-5p sequence with Liaoning cashmere goat

cte-miR-1993 MIMAT0009701， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UAUUAUGCUGAUAUUCACGAGA，通過DNAMAN 4.0生物軟件進(jìn)行序列比對，得出圖7。

使用BiBiServ分析microRNA二級結(jié)構(gòu)，ctemiR-12序列為UGAGUAUUACAUCAGGUACUGA，且長度為22 bp，其靶標(biāo)前體長度為47 bp，mfe值為-22.9 kcal/mol。見圖8。

4 討論

圖7 遼寧絨山羊突變后序列與bta-miR-2461-3p序列比對Fig.7 Alignment of bt-miR-2461-3p sequence with Liaoning cashmere goat mutants

microRNA是一類長度約22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，它能夠通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制靶基因的翻譯或降解靶基因。microRNA參與復(fù)雜的生物學(xué)過程[6]。microRNA是一組不編碼蛋白質(zhì)自身不具備開放閱讀框架的短序列RNA，在真核生物中廣泛存在，在進(jìn)化上具有高度保守性，表達(dá)上具備嚴(yán)格的時(shí)空性和組織特異性，且在不同生物體間行使相同的功能。microRNAs在羊絨生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著對microRNA的深入研究，已從識別microRNA，闡明作用機(jī)制，轉(zhuǎn)移到鑒定其功能。本試驗(yàn)試圖通過生物信息分析ESR基因3′UTR區(qū)的相關(guān)功能性SNP來篩選不同的microRNA，研究證明，用MicroInspector軟件將靶標(biāo)基因與山羊的microRNA結(jié)合情況分析后發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因的3′-UTR不發(fā)生結(jié)合情況。發(fā)生突變后結(jié)合的ctemiR-278，648 bp位點(diǎn)C到G的突變。分析microRNA二級結(jié)構(gòu)，cte-miR-278序列為ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCA，且長度為24 bp，mfe值為-22.90 kcal/mol這也意味著，預(yù)測得到的潛在靶microRNA即cte-miR-278具有相當(dāng)穩(wěn)定且重要的意義，可能參與ESR基因的表達(dá)調(diào)控。

圖8 cte-miR-12結(jié)構(gòu)的特征Fig.8 Characteristics of cte-miR-12 structure

5 小結(jié)

5.1 遼寧絨山羊群體中ESR基因存在T-305C突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)在遼寧絨山羊群體中處于中多態(tài)。

5.2 cte-miR-12有可能調(diào)控ESR基因參與遼寧絨山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響。

5.3 本文通過對ESR基因的3′UTR區(qū)突變前后與microRNA的結(jié)合情況進(jìn)行分析，篩選出相關(guān)microRNA，旨在為今后羊的多態(tài)性的研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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