HPLC法測(cè)定抗癆散中芥子堿硫氰酸鹽的含量

杜建紅，鐘元高，凃顯琴，何德云

抗癆散是成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，主要成分由炮姜、川貝母、芥子、姜半夏等組成，具有清熱、滋陰、解毒、消核、化瘀等功效，臨床主要用于骨結(jié)核的治療。原《總后衛(wèi)生部非標(biāo)準(zhǔn)制劑標(biāo)準(zhǔn)》主要采用薄層色譜法監(jiān)測(cè)該品種質(zhì)量，未規(guī)定對(duì)任何成分進(jìn)行含量測(cè)定。根據(jù)抗癆散處方成分及臨床應(yīng)用，為了更好監(jiān)測(cè)該制劑質(zhì)量，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[1]，擬采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定抗癆散中芥子堿硫氰酸鹽的含量，并進(jìn)行方法學(xué)研究，供同仁參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號(hào)：Waters 2695）；KQ5200E型超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）；電子天平（型號(hào)：METILER AE240S ）。

1.2 藥品試劑 芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)：111702-201303，純度：95.1%）；色譜乙腈（Fisher公司）；甲醇分析純（純度≥95.5%，成都市科龍化工試劑廠）；磷酸二氫鉀分析純（含量≥99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水（自制）?？拱A散（成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院生產(chǎn)，批號(hào)：20160811、20160923、20161114）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備[1]取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相制成0.02 mg/ml的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備[1]取抗癆散約2 g，精密稱(chēng)定[1]，置 100 ml量瓶中，加甲醇 50 ml，超聲處理（功率 200 w，頻率 40 kHz）45 min，放冷至室溫，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備[2]按照處方制備未含芥子的陰性樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：島津inertsustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.08 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（12∶88）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量：20 μl。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按照上述色譜條件，依次進(jìn)樣對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，記錄色譜圖（圖1），芥子堿硫氰酸鹽與相鄰雜質(zhì)峰分離度為2.1，符合藥典符合規(guī)定（分離度應(yīng)不低于1.5），陰性對(duì)照溶液在芥子堿硫氰酸鹽出峰處未檢測(cè)到峰，專(zhuān)屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)定，置250 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解，稀釋?zhuān)ㄈ荩鳛閷?duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相制成含芥子堿硫氰酸鹽0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/ml的溶液，作為考察線性關(guān)系的對(duì)照品溶液。采用上述方法分別進(jìn)樣上述對(duì)照品溶液，記錄色譜圖。以峰面積（A）對(duì)進(jìn)樣濃度C（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，得芥子堿硫氰酸鹽線性方程為：A=6×107C-42276（n=5），r=0.9999。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄主峰峰面積，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)平均偏差（RSD）為0.57%（n=5），表明該方法精密度試驗(yàn)良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20160811抗癆散樣品約2 g，精密稱(chēng)定，按照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖及稱(chēng)樣量，以外標(biāo)法計(jì)算每份芥子堿硫氰酸鹽含量，考察重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果RSD分別為1.53%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20160811），按供試品溶液制備方法制備，室溫放置， 在同 1 d 內(nèi)第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 按上述色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽含量，結(jié)果RSD為0.84%（n=8），表明芥子堿硫氰酸鹽在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取抗癆散樣品（批號(hào)：20160811，已測(cè)含芥子堿硫氰酸鹽為0.6034 mg/g）1 g各6份，分別置100 ml量瓶中，再分別加入“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各 7.5 ml，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備回收率供試品溶液[2]，依法進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖及稱(chēng)樣量，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽回收率。從表1可見(jiàn)，芥子堿硫氰酸鹽加樣回收率良好。

表1 芥子堿硫氰酸鹽回收率結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定 取3批抗癆散（批號(hào)：20160811、20160923、20161114）各 2 g，精密稱(chēng)定，每批次平行處理2份，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣供試品溶液與芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液，以外標(biāo)法計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽含量，結(jié)果顯示3批樣品含量分別為0.60、0.58、0.60 mg/g。3 討論

抗癆散原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法過(guò)于簡(jiǎn)單，不能有效監(jiān)控制劑質(zhì)量，已不能滿足最新藥典要求。為了更加有效控制藥品質(zhì)量，確?；颊哂盟幇踩狙芯繀⒖肌吨袊?guó)藥典》2015年版一部，考察HPLC測(cè)定該品種中芥子堿硫氰酸鹽含量的適用性。通過(guò)對(duì)該方法檢測(cè)芥子堿硫氰酸鹽的線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、回收率等重要方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，HPLC法測(cè)定本品時(shí)精密度、重復(fù)性、回收率均良好，且該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，故能作為測(cè)定本品主要成分芥子中芥子堿硫氰酸鹽含量的測(cè)定方法，為建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:160-161.

[2] 馬永貴，李自明，閔敏，等.高效液相色譜法測(cè)定多樂(lè)寶林片中鹽酸可樂(lè)定的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào).2010，29（4）：522-524.