卵巢癌動(dòng)物模型制備的研究進(jìn)展

李冬冬，王莉，鐘潔，凌晨祁，梁延平

(上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院婦科，上海 200438)

卵巢癌是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第五大原因，5年生存率僅為44%，約75%的卵巢癌患者檢出時(shí)即為晚期[1,2]。該病目前常規(guī)的治療方案手段為手術(shù)切除病變組織，然后進(jìn)行紫杉類(lèi)聯(lián)合鉑類(lèi)為主的化療。盡管針對(duì)卵巢癌手術(shù)和化療，開(kāi)展了大量的研究工作，并在不斷改進(jìn)，但是在過(guò)去的30年里卵巢癌患者的5年生存率一直很低。目前導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生發(fā)展的遺傳和分子機(jī)制仍不清楚，同時(shí)缺乏可靠的早期篩查手段，卵巢癌的臨床治療效果也較差，這些因素嚴(yán)重影響著卵巢癌的控制。人類(lèi)疾病動(dòng)物模型作為重要的研究工具，在人類(lèi)疾病的發(fā)生機(jī)制研究、防治藥物開(kāi)發(fā)、診斷方法篩選等方面起著不可替代的作用[3,4]。在卵巢癌的研究工作中，已經(jīng)建立了大量的動(dòng)物模型，如自發(fā)型、誘發(fā)型、移植型、基因干預(yù)型等模型。這些模型的制備方法各有特色，有效推動(dòng)了卵巢癌不同領(lǐng)域的研究。本文就目前常用的卵巢癌模型的制備方法、特點(diǎn)及判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了綜述。

1 自發(fā)型

1.1 小鼠模型

1.1.1 模型復(fù)制方法

小鼠作為目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，長(zhǎng)期的飼養(yǎng)繁殖過(guò)程中形成了諸多易患腫瘤或者腫瘤抵抗的近交系品系。例如RⅢ系、C3H系、C3HeB系、CE系等均有自發(fā)性卵巢癌發(fā)病率較高的品系[5]。

1.1.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

自發(fā)性腫瘤模型主要依賴(lài)剖檢進(jìn)行判斷，當(dāng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)卵巢腫大有突起，病理切片顯示出現(xiàn)癌變即可判定發(fā)生自發(fā)性卵巢癌。這些自發(fā)性卵巢癌模型與實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的腫瘤相比更加接近人類(lèi)腫瘤，更加有利于研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，但該類(lèi)模型腫瘤發(fā)生、發(fā)展的時(shí)間不一，很難實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一開(kāi)展。

1.2 雞模型

1.2.1 模型復(fù)制方法

Mocka等[6]將68周齡的海蘭W-36白殼蛋雞喂養(yǎng)至174周時(shí)，其卵巢癌發(fā)生率能夠達(dá)到23%。

1.2.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

該模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要依賴(lài)剖檢后的病理學(xué)診斷，如病理切片顯示出現(xiàn)癌變(例如低分化卵巢癌與子宮內(nèi)膜樣卵巢癌)即可判定為自發(fā)性卵巢癌[6-7]。雞作為卵巢癌的自發(fā)模型有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如自發(fā)性卵巢癌發(fā)生率高于其他物種[8]；與人類(lèi)卵巢癌相似，普遍存在p53基因突變[9]。同時(shí)該模型也有很大的局限性，首先雞的解剖結(jié)構(gòu)及病理生理與人類(lèi)存在很大區(qū)別，另外該模型制備周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)動(dòng)物量大、耗資大。

1.3 東方田鼠模型

1.3.1 模型復(fù)制方法

俞遠(yuǎn)京等[10]在飼養(yǎng)培育東方田鼠封閉群時(shí)，發(fā)現(xiàn)該種群有較高的卵巢癌發(fā)生率。飼養(yǎng)至9～15 月齡時(shí)即可陸續(xù)出現(xiàn)東方田鼠自發(fā)性卵巢癌模型。

1.3.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

患病的東方田鼠腹部膨大、體重顯著升高，解剖時(shí)腹腔有大量深紅色腹水，卵巢腫大形成囊狀物，其表面有突起；病理切片檢查可以觀(guān)察到上皮細(xì)胞增生活躍，排列失去極性，細(xì)胞核形態(tài)大小不一，多見(jiàn)分裂像，組織增生堆積，過(guò)度增生區(qū)能夠觀(guān)察到腺體“背靠背”或 “篩狀”排列，這時(shí)即可判斷卵巢癌的發(fā)生[10]。

1.4 長(zhǎng)爪沙鼠模型

1.4.1 模型復(fù)制方法

多個(gè)實(shí)驗(yàn)室繁育的長(zhǎng)爪沙鼠種群具有較高自發(fā)性卵巢癌的發(fā)病率，從8.4%～26.5%不等，即使野生的長(zhǎng)爪沙鼠自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率仍然很高[11-12]。Benitz等[13]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠繁殖到2年齡時(shí)，便會(huì)大量產(chǎn)生自發(fā)性腫瘤，其中卵巢癌發(fā)病率最高。

1.4.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

長(zhǎng)爪沙鼠生長(zhǎng)到2年齡時(shí)自發(fā)性卵巢癌發(fā)病率能夠達(dá)到12.5%，在進(jìn)行解剖和組織學(xué)診斷時(shí)，如卵巢出現(xiàn)癌變特征，即為自發(fā)性卵巢癌[13]。長(zhǎng)爪沙鼠卵巢癌發(fā)生率較高，但是培育時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要2年以上，此外，長(zhǎng)爪沙鼠還容易自發(fā)產(chǎn)生其他多種腫瘤，如果產(chǎn)生其他腫瘤，將進(jìn)一步干擾卵巢癌發(fā)生機(jī)制的研究。

2 誘發(fā)型

2.1 二羥甲基丁酸 (DMBA) 誘導(dǎo)法

2.1.1 模型復(fù)制方法

二羥甲基丁酸 (DMBA)是誘發(fā)動(dòng)物卵巢癌的常用藥物，采用卵巢皮質(zhì)埋置DMBA處理的布片或者直接注射DMBA均能誘發(fā)卵巢癌產(chǎn)生。該模型起初的制作方法是卵巢囊內(nèi)埋置DMBA浸泡的絲線(xiàn)，其成功率只有10%～45%[14-15]。后來(lái), Crist等[14]進(jìn)行了改進(jìn)，將純度99% 的DMBA在124℃時(shí)浸漬絲線(xiàn)后直接植入Wistar大鼠卵巢囊內(nèi)，26周后即可出現(xiàn)卵巢癌，52周后卵巢癌的發(fā)病率達(dá)到77%。Huang等[16]用DMBA浸潤(rùn)的布片埋入Wistar大鼠雙側(cè)卵巢中，32周后，128只手術(shù)大鼠有90只發(fā)生卵巢腺癌。Liu等[17]將DMBA直接注入C57BL/6 J小鼠卵巢囊中，20周后約77.8%小鼠出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)的跡象，并伴有腹水。

2.1.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

大鼠在埋置DMBA浸潤(rùn)的布片175 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)卵巢癌，230 d時(shí)卵巢癌發(fā)展較快。1年后卵巢癌發(fā)病率為77%。該模型大多數(shù)腫瘤(74%)組織學(xué)類(lèi)型有兩型，腺癌及卵泡膜細(xì)胞瘤。小鼠DMBA直接注射20周后，卵巢腫瘤平均重量明顯增加。卵巢癌的診斷指標(biāo)CA125顯著增加，病理切邊檢查顯示，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的多形性和分裂像，胞漿率高，組織中有新的血管形成。這些癥狀的出現(xiàn)標(biāo)志著卵巢癌模型成功建立[16,18-19]。大鼠DMBA縫合模型產(chǎn)生上皮來(lái)源的腫瘤組織學(xué)上類(lèi)似于人類(lèi)，有助于研究卵巢癌在體內(nèi)的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移情況。該方法部分模型中約39%為腺癌，能夠出現(xiàn)人類(lèi)上皮性卵巢腫瘤相似的上皮和代謝標(biāo)志物。

2.2 4-乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD)聯(lián)合DMBA誘導(dǎo)法

2.2.1 模型復(fù)制方法

乙烯基-1-環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD)是誘導(dǎo)卵巢早衰的常用試劑[20]。Kanter等[21]連續(xù)20 d腹腔注射Fisher 344大鼠160 mg/kg的VCD，65 d后每日監(jiān)測(cè)發(fā)情狀況，當(dāng)出現(xiàn)發(fā)情不規(guī)律時(shí)，將DMBA丙酮溶液浸泡的無(wú)菌縫線(xiàn)埋置在卵巢囊中，約5個(gè)月之后出現(xiàn)卵巢腫瘤。

2.2.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

組織學(xué)診斷病變部位出現(xiàn)腺癌、顆粒-卵泡膜細(xì)胞瘤、Sertoli-Leydig細(xì)胞瘤特征，這說(shuō)明該方法成功制備了卵巢癌動(dòng)物模型[21]。該模型很好的模擬了與絕經(jīng)期有關(guān)的激素水平和其他因素的表征，可用于研究卵巢癌的發(fā)生研究或者篩選卵巢癌預(yù)防治療藥物。但是該模型誘導(dǎo)的卵巢早衰不同于人類(lèi)的自然早衰。

3 移植型

3.1 皮下移植瘤模型

3.1.1 模型復(fù)制方法

該方法可分為細(xì)胞懸液接種和組織塊移植接種兩種。細(xì)胞懸液接種法主要是將體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞株接種于裸鼠皮下。目前常用的卵巢癌細(xì)胞系有SKOV3、ID8、A2780、HO-8910、ES-2、COC1、OCCAR-3、CAOV-3等。例如Wu等[22]將改造的A2780細(xì)胞注射至雌性BALB/c裸小鼠皮下，數(shù)周內(nèi)可觀(guān)察到皮下腫瘤生長(zhǎng)。組織塊移植法是將新鮮切除的腫瘤標(biāo)本邊緣生長(zhǎng)較快的部分接種于裸鼠皮下[23]。組織塊移植法可避免細(xì)胞污染、接種時(shí)間長(zhǎng)等導(dǎo)致細(xì)胞活力低下等情況，故在大批量卵巢癌模型建立中較多選用此方法。使用病人新鮮的腫瘤組織移植于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，建立的異種移植模型又稱(chēng)為PDX(patient-derived xenograft)模型，這種模型大多采用皮下移植的方法。Richard等[24]將腫瘤組織制成細(xì)胞混合物注射到NSG小鼠皮下，能夠產(chǎn)生人源化的腫瘤模型。同時(shí)共植入腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞能夠長(zhǎng)期存活，并保持功能，它們產(chǎn)生的生物活性因子，有助于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。

3.1.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

該類(lèi)模型評(píng)價(jià)可以采用測(cè)量瘤體長(zhǎng)短徑，根據(jù)公式腫瘤體積V(mm3)=0.5×a×b2(a=長(zhǎng)徑，b=短徑)，計(jì)算瘤體積，當(dāng)腫瘤體積不斷增大時(shí)，即可判斷模型構(gòu)建成功[22,25]。該類(lèi)模型在研究基因功能或者研究抗腫瘤機(jī)制、篩選抗腫瘤藥物時(shí)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是該模型常選擇裸鼠進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境有別于正常肌體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)，并且不易形成轉(zhuǎn)移，因此生物學(xué)表現(xiàn)與臨床卵巢癌病例有很大差別。組織移植法的優(yōu)點(diǎn)是所移植的腫瘤能夠保持原有的結(jié)構(gòu)，并且能長(zhǎng)時(shí)間存活，避免了宿主細(xì)胞干擾或浸潤(rùn)。但其缺點(diǎn)也是未能準(zhǔn)確反映腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。此外，PDX模型較好地保持了原發(fā)腫瘤的遺傳特性和異質(zhì)性，在腫瘤的個(gè)體化治療研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

3.2 卵巢癌原位模型

3.2.1 模型復(fù)制方法

該方法是將體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞注射到動(dòng)物卵巢表面，從而產(chǎn)生腫瘤。如Cho等[26]將ID8細(xì)胞注射到C57BL/6雌性小鼠左側(cè)卵巢囊中，可成功制備卵巢癌原位模型。Koya等[27]將卵巢癌細(xì)胞注射到BALB/c 裸鼠卵巢表面成功構(gòu)建卵巢癌轉(zhuǎn)移模型。He等[28]將ID8細(xì)胞注射入卵巢囊中，亦可成功制備該類(lèi)模型。

3.2.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

卵巢癌細(xì)胞注射到動(dòng)物卵巢囊中后，如觀(guān)察到動(dòng)物腹圍增加，12周最為顯著，腹部超聲監(jiān)測(cè)血流改變。對(duì)側(cè)卵巢以及肝、腸、胃、腹膜和脾等均等觀(guān)察到轉(zhuǎn)移性病灶[26]，因此，該方法成功構(gòu)建了原發(fā)性卵巢上皮癌并伴有繼發(fā)性卵巢癌及其他臟器轉(zhuǎn)移癌。該模型有利于研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散機(jī)制，同時(shí)原位移植影響因素較多，成功率低，因此該方法建模難度較大。

3.3 腹腔移植瘤模型

3.3.1 模型復(fù)制方法

Rosa等[29]將SKA 或SKCXCR2細(xì)胞腹腔注射到SHC裸鼠體內(nèi)，或者Kim等[30]在雌性NCr-nu裸鼠腹腔中注射卵巢癌細(xì)胞, 均能成功建立裸鼠上皮性卵巢癌動(dòng)物模型。Walton等[31]利用 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的Trp53單敲除和Trp53、Brca2雙敲除的ID8細(xì)胞，并將該細(xì)胞移植到6～8周齡的 C57BL/6小鼠腹腔中，成功構(gòu)建了漿液性卵巢癌模型。

3.3.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

小鼠出現(xiàn)腹水的臨床表現(xiàn)，如大量腹水積聚，體重持續(xù)增加，活動(dòng)遲緩等時(shí)，表明該類(lèi)模型制備成功。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能很好地表現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，常用于腹腔化療藥物的篩選。但是由于腹水形成發(fā)展較快，該模型生存時(shí)間較短，不利于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。

3.4 腎包膜移植模型

3.4.1 模型復(fù)制方法

Lee[32-33]和Kim[34]等將患者腫瘤標(biāo)本切成小于2～3 mm的小塊，植入6～8周齡的NOD/SCID小鼠左腎包膜下，制成原代腫瘤組織的腫瘤移植模型(PDX模型)。

3.4.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

如檢測(cè)到移植的腫瘤生長(zhǎng)即表明模型制備成功。該模型在15 d內(nèi)體積能夠增加2倍，成功植入率能夠到達(dá)95%，其組織病理學(xué)特征與移植后相比呈高度相似；移植后30～60 d內(nèi)所檢測(cè)的免疫表型能夠保持(91±5)%的一致性[32-33]。該模型具有原發(fā)腫瘤的遺傳特性和異質(zhì)性，可以用于腫瘤治療藥物的篩選。

3.5 淋巴轉(zhuǎn)移模型

3.5.1 模型復(fù)制方法

Du等[35]將穩(wěn)定表達(dá)VEGF-D的乳腺癌SKOV3細(xì)胞，注射到7～8周齡的裸鼠左后肢腳墊，12～15周后可以觀(guān)察到乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶。

3.5.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

當(dāng)發(fā)現(xiàn)裸鼠腹股溝等處出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶時(shí)即可判斷模型制備成功。腫瘤轉(zhuǎn)移至周?chē)馨徒Y(jié)通常是腫瘤擴(kuò)散的第一步，其通過(guò)血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至其他部位[36-37]。該模型有利于研究卵巢癌經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)的擴(kuò)散，但是該模型技術(shù)要求較高，成功率較低。

4 基因干預(yù)型

4.1 轉(zhuǎn)基因法

4.1.1 模型復(fù)制方法

Connolly等[38]將含MISIIR基因啟動(dòng)子的載體注射到C57BL/6 和C3H 品系F1代0.5 d胚胎中，胚胎植入假孕雌性后成功建成了MISIIR轉(zhuǎn)基因小鼠，該品系小鼠有約50%的個(gè)體6～13周便可發(fā)生卵巢癌腫瘤。

4.1.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

該品系小鼠在6～13周時(shí)，尸檢可見(jiàn)雙側(cè)卵巢有大小不等的腫塊存在，小鼠腹腔腫瘤為血性腹水，病理學(xué)檢測(cè)顯示卵巢組織中幾乎完全由低分化、細(xì)胞核深染、多邊形的腫瘤細(xì)胞占據(jù)，這表明小鼠發(fā)生卵巢癌[38]。該品系小鼠能夠表現(xiàn)出表達(dá)漿液性卵巢上皮性癌病例特征。

4.2 基因敲除法

4.2.1 模型復(fù)制方法

Chen等[39,40]發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素受體敲除(FORKO)小鼠能夠發(fā)生卵巢腫瘤。Abel等[41]構(gòu)建的卵泡刺激素(FSH)受體及其配體同時(shí)敲除的小鼠模型，形成了年齡相關(guān)卵巢增生、上皮性包涵囊腫、管狀結(jié)構(gòu)和卵巢病理類(lèi)似的漿液性囊狀腺癌。

4.2.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

FOR-KO小鼠生長(zhǎng)到12個(gè)月以上時(shí)，92%的小鼠表現(xiàn)出多種卵巢病理，并且大多數(shù)腫瘤位于右側(cè)卵巢，類(lèi)型多為漿液性腺瘤和囊腺癌。

4.3 條件性基因敲除法

4.3.1 模型復(fù)制方法

Wu等[42]將條件性失活PTEN基因小鼠和 條件性失活結(jié)腸腺瘤樣息肉病(APC)基因雜交獲得的雙基因條件性敲除品系(APC-/PTEN-)中，將5×107CFU的AdCre注射到56～70日齡該品系小鼠右側(cè)卵巢囊腔中，100%發(fā)生人樣卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌。此外，條件性敲除Tp53和Rb1基因小鼠97%的個(gè)體能夠發(fā)生卵巢腫瘤[43]。條件性敲除小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中的Brca1，能夠?qū)е聦?dǎo)致卵巢和子宮角囊性腫瘤的發(fā)生[44-45]。

4.3.2 成模標(biāo)準(zhǔn)及其特點(diǎn)

APC-/PTEN-小鼠卵巢癌的發(fā)生率為100%，并且具有潛伏期短，75%以上小鼠能夠快速發(fā)展為轉(zhuǎn)移性癌癥。該模型腫瘤的病程與未經(jīng)治療的人卵巢癌非常相似，76%的小鼠發(fā)展為血性腹水，21%的小鼠出現(xiàn)腹膜擴(kuò)散。此外，其卵巢癌形態(tài)學(xué)與人類(lèi)卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌很相似，均存在不同的腺體和鱗狀分化病灶，并且其生物學(xué)特點(diǎn)，與基因表達(dá)等均類(lèi)似于人類(lèi)癌癥，甚至存在相同的信號(hào)通路缺陷[42]。

綜上所述，目前常用的卵巢癌動(dòng)物模型的制備，極大的推動(dòng)了卵巢癌發(fā)病機(jī)制的研究，以及檢查和治療手段的升級(jí)。這些不同方法制備的動(dòng)物模型，一定程度上滿(mǎn)足了卵巢癌多角度的深入研究。但是，這些動(dòng)物模型的制備方法同時(shí)存在很多不足，例如：自發(fā)性腫瘤模型以嚙齒類(lèi)和雞為主，其卵巢生物學(xué)特性與人類(lèi)有很大差別，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制亦與人類(lèi)有很大區(qū)別?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法方法比較復(fù)雜，需要進(jìn)行手術(shù)分離出卵巢，對(duì)動(dòng)物損傷較大，并且目前用的化學(xué)藥物比較單一，以DMBA誘導(dǎo)為主。目前最常見(jiàn)的移植型模型多數(shù)采用裸鼠進(jìn)行操作，不能準(zhǔn)確模擬人體內(nèi)的免疫微環(huán)境。另外，基因干預(yù)法造模因素雖然成功率較高，但由于其基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，僅適合于研究相應(yīng)的基因功能。這些因素限制著卵巢癌動(dòng)物模型的研究，制約著卵巢癌疾病的研究。因此，開(kāi)發(fā)更加接近人類(lèi)的卵巢癌動(dòng)物模型的制備方法，仍然是我們今后工作的重點(diǎn)。

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