常用大便失禁動物模型造模方法進(jìn)展

王迪，王琛，曹永清，陸金根，董青軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

大便失禁(fecal incontinence)又稱肛門失禁(anal incontinence)，通常指肛門括約肌對氣體及糞便的控制能力減弱或消失，導(dǎo)致患者不自主地排泄粘液、液體或固體的糞便，且至少持續(xù)三個月[1-4]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，大便失禁的發(fā)病率仍無統(tǒng)一的結(jié)論[2]，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]報道，全球社區(qū)大便失禁的發(fā)病率從0.8%～7.8%不等，男女發(fā)病率約為3∶1～6∶1。另外根據(jù)國外幾項基于社區(qū)的大型調(diào)查研究表明，社區(qū)居住的婦女大便失禁發(fā)病率在7%～15%不等，住院病人則達(dá)到18%～33%，在養(yǎng)老院等機(jī)構(gòu)發(fā)病率更高，且隨年齡增長大便失禁發(fā)病率具有逐漸增高的趨勢。

大便失禁的致病因素很多，主要有以下幾種：(1)糞便成分異常，如腸易激綜合征、感染性腸病、感染性腹瀉等；(2)直腸容量和順應(yīng)性下降，如直腸容量不足的保肛手術(shù)(包括低位前切除術(shù)、結(jié)腸肛管吻合術(shù)等)；(3)直腸感覺功能不全，如神經(jīng)病變(包括癡呆、腦血管意外、運(yùn)動性共濟(jì)失調(diào)、多發(fā)性硬化等)、充溢性大便失禁(包括糞便嵌塞、功能性大便失禁、精神病治療藥等)；(4)肛管括約肌或盆底肌功能失調(diào)，如損傷(包括產(chǎn)科損傷、直腸肛管手術(shù)、炎癥等)、盆底肌神經(jīng)支配障礙(包括陰部神經(jīng)病變、盆底神經(jīng)損傷等)[4]。同時，大便失禁也會引起一系列并發(fā)癥，如患者肛周皮膚長期受溢出糞便的刺激，經(jīng)常遭受潮濕和代謝產(chǎn)物的侵蝕，容易造成會陰部、骶尾部皮炎及壓力性潰瘍等[6]。更加重了病人的身心壓力，同時也給家屬及醫(yī)務(wù)人員的護(hù)理工作帶來了極大負(fù)擔(dān)。

目前，大便失禁的治療方法繁多，療效尚不肯定，作用機(jī)制尚不確切，因此有必要開展大量的基礎(chǔ)實驗研究，通過動物實驗尋找療效確切的治療方法。本文總結(jié)國內(nèi)外幾種經(jīng)典的大便失禁動物模型的造模方法，并進(jìn)行了深入闡述，為大便失禁的機(jī)理和臨床治療方案奠定基礎(chǔ)。

1 肛門內(nèi)外括約肌切斷法

臨床上，因肛瘺手術(shù)、會陰部外傷、分娩時會陰部撕裂等原因造成患者肛門內(nèi)括約肌、恥骨直腸肌或者肛門外括約肌斷離，使肛管不能保持有效的壓力阻止糞便排出，從而造成肛門漏氣、漏便等大便失禁癥狀[6]。因此通過切斷動物的肛門內(nèi)外括約肌可以制作大便失禁的動物模型。

方法：成年大鼠，濃度為1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)或者濃度為10%的水合氯醛(4 mL/kg)，進(jìn)行腹腔注射麻醉[8-9]，截石位6點或7點位處縱行切開大鼠內(nèi)外括約肌，創(chuàng)面開放，術(shù)后可肌注 0.75% 布比卡因(0.5 mg/kg)鎮(zhèn)痛，可預(yù)防性應(yīng)用抗生素防止傷口感染。手術(shù)完成后將大鼠放置在恒溫箱中直至蘇醒，以降低大鼠的死亡率。模型建立后，每日設(shè)定進(jìn)食、飲水量，定時觀察排便狀況；若出現(xiàn)大便次數(shù)增多，質(zhì)稀不成形，甚或大便失禁，證明造模成功[10-12]。肛門內(nèi)括約肌損傷主要表現(xiàn)為肛管靜息壓(ARP)下降，肛管功能長度縮短，直腸肛管抑制反射減弱。肛管外括約肌損傷以肛管最大收縮壓明顯降低為主[7]。因此，通過測量造模前后大鼠的肛門靜息壓和肛管最大收縮壓可驗證模型是否成功。

2 陰部神經(jīng)切斷法

解剖研究表明，陰部神經(jīng)(pudendal nerve, PN)的分支直腸下神經(jīng)支配肛門外括約肌(external anal sphincter, EAS)，若陰部神經(jīng)及其分支損傷，則可影響EAS的功能從而造成大便失禁[13]。據(jù)此，可以切斷大鼠陰部神經(jīng)模擬陰部神經(jīng)損傷造成大便失禁模型。

方法：成年大鼠，常規(guī)腹腔注射麻醉后(麻醉方法同前)，呈俯臥位(prone position)固定。在兩后肢之間的背部區(qū)域退毛備皮，碘伏或酒精消毒后，在兩后肢之間、脊柱正中縱行切開皮膚，于脊柱和股骨大轉(zhuǎn)子之間依次縱行切開最大皮肌和臀大肌，沿切口向股骨方向及下方鈍性分離，可在肌肉深面即坐骨直腸窩內(nèi)看到一粗大且橫向走行的神經(jīng)，即腰骶干。沿腰骶干繼續(xù)向上分離，看到其分支股后皮神經(jīng)，繼續(xù)向上分離，于近脊柱處可見兩支神經(jīng)分支，近處一支即為陰部神經(jīng)，與陰部內(nèi)動、靜脈伴行，剝離、剪斷雙側(cè)神經(jīng)即可[14-15]。術(shù)后用3/0縫線逐層縫合肌肉和皮膚。常規(guī)應(yīng)用抗生素預(yù)防感染，并將大鼠放置在保溫箱內(nèi)至蘇醒。陰部神經(jīng)切斷后，肛門括約肌失去神經(jīng)支配，表現(xiàn)為肛管靜息壓和最大收縮壓均明顯下降，肛管功能長度縮短，直腸肛管抑制反射減弱等。因此，同樣可以通過測定大鼠的肛門壓力來驗證模型成功與否[7]。

3 直腸下神經(jīng)切斷法

直腸下神經(jīng)(inferior rectal nerve，IRN)是陰部神經(jīng)的分支，支配EAS，因此，可以切斷IRN來制作肛門失禁模型。

方法：成年大鼠，麻醉后(方法同前)，呈仰臥位(supine position)。肛周退毛備皮，并用碘伏或酒精消毒皮膚。距離肛門或陰道約0.5 cm處做一長約2 cm的縱行切口。首先找到陰部內(nèi)血管，以協(xié)助定位IRN。對IRN實施電刺激，可以引起EAS的快速短暫收縮。據(jù)此可用電刺激法精確IRN的位置。確定IRN的位置后，可用腦動脈瘤夾夾閉神經(jīng)。夾閉的腦動脈瘤夾可對神經(jīng)產(chǎn)生持續(xù)的壓力，夾閉60 s間歇60 s反復(fù)兩次，即可3/0縫線縫合傷口[16]。常規(guī)肌注止痛藥物，預(yù)防性應(yīng)用抗生素，術(shù)后將大鼠放置保溫箱至蘇醒，方法均同前。此方法模型可持續(xù)4～6周。

4 模擬產(chǎn)傷引起肛門失禁法

除肛門直腸手術(shù)、直腸脫垂等原因外，產(chǎn)傷是引起女性大便失禁的一個常見因素[17]。因此，可以采用經(jīng)大鼠盆腔，在子宮后行持續(xù)性球囊壓迫的方法來模擬分娩時胎兒對盆底肌肉等的壓迫來制作便失禁模型。

方法：成年雌性大鼠，常規(guī)麻醉后，仰臥位固定。腹部退毛備皮，碘伏擦拭或者噴灑70%醫(yī)用消毒酒精進(jìn)行消毒。沿大鼠腹部正中線做一起于恥骨聯(lián)合終于腹部中間位置的長約3 cm的縱行切口，撥開網(wǎng)膜及輸卵管等以獲得清晰視野并能夠精確定位球囊的位置。然后將兩個兒童導(dǎo)尿管放置在子宮后方，每個球囊的最大容量為1.5 mL。為測量子宮后球囊擴(kuò)張時盆腔內(nèi)的壓力變化，同時在大鼠陰道內(nèi)放置一充滿水的大鼠左心室球囊壓力導(dǎo)管，并將導(dǎo)管連至一壓力感受器。經(jīng)放大后的信號在記錄紙上記錄下來。經(jīng)陰道測量的平均壓力維持在130 mmHg，這與女性在生產(chǎn)時盆腔所承受的壓力相當(dāng)。氣囊充氣擴(kuò)張1 h后即可排除空氣。此時檢查確認(rèn)腹部有無出血跡象，處理好后縫合即可。2/0縫線縫合筋膜，3/0縫線縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)止痛、預(yù)防性應(yīng)用抗生素，并將大鼠放置在保溫箱內(nèi)直至蘇醒。此法所做的模型可維持4周左右[16]。

5 雙側(cè)骶神經(jīng)注射藥物法

陰部神經(jīng)來源于骶神經(jīng)叢的S2-S4骶神經(jīng)根，發(fā)出分支支配會陰部皮膚和肌肉[7]。肛門外括約肌為骨骼肌，受意識支配，產(chǎn)生30% ARP，有較強(qiáng)的節(jié)制排便功能[18-19]。Cosovic等[20]研究發(fā)現(xiàn)，局部注射利多卡因等局麻藥物可使坐骨神經(jīng)在1周后出現(xiàn)變性。另有研究表明[21]局麻藥物對神經(jīng)損害程度隨濃度升高而加重，當(dāng)藥物濃度達(dá)到一定水平時，可嚴(yán)重破壞神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)使神經(jīng)細(xì)胞功能永久性不可逆的喪失。因此，黃宗海等[19]采用對兔的雙側(cè)骶神經(jīng)注射高濃度麻醉藥品的方法來制作肛門失禁模型。

神經(jīng)定位：對兔行肛門外括約肌肌電圖(EMG)檢查同時進(jìn)行穿刺定位骶神經(jīng)。

方法：成年新西蘭兔，建立兔耳緣靜脈通路，30 g/L戊巴比妥(1 mL/kg)靜脈注射麻醉。在兔骶部捫及骶骨下部，按照第4骶神經(jīng)的解剖部位進(jìn)行定位穿刺。在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無關(guān)電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路。電流l.5 mA，脈沖頻率1 Hz。當(dāng)與刺激電極相連的穿刺針進(jìn)針達(dá)一定深度，出現(xiàn)與脈沖電流同步的肛門外括約肌收縮運(yùn)動時，表明穿刺針接近或抵達(dá)第4骶神經(jīng)，此時將脈沖電流關(guān)至0.5 mA，肛門外括約肌仍在收縮運(yùn)動，表明已刺中第4骶神經(jīng)。記錄電極刺入的位置、方向、深度。然后調(diào)整刺激電流參數(shù)設(shè)置為方波，頻率1 Hz，波寬50 μs，強(qiáng)度5 mA。記錄肛門外括約肌的EMG數(shù)據(jù)文件。在維持上述電流刺激及監(jiān)測肛管內(nèi)壓力變化的情況下，于定位好的第4骶神經(jīng)處，回抽無血液，在兩側(cè)第4骶神經(jīng)處緩慢注射50 g/L羅哌卡因0.1 mL/kg+腎上腺素(1∶250000)，總劑量平均分為兩側(cè)注射。黃宗海等研究證實此方法制作的緊迫性大便失禁的模型在第8周依舊具有較好的穩(wěn)定性。

綜上所述，雖然引起大便失禁的病因復(fù)雜多樣，但臨床上主要以括約肌損傷或者神經(jīng)損傷多見。眾所周知，大鼠肛門括約肌的愈合能力極強(qiáng)，因此，大鼠肛門括約肌損傷后自愈時間較短，括約肌損傷的便失禁模型維持時間也相應(yīng)縮短。目前，隨著人口老齡化社會的到來，老年性大便失禁的患者呈逐年上升趨勢，因便失禁而引起的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)越來越大，此類患者主要是神經(jīng)和肌肉退化出現(xiàn)的肛門括約能力減弱或消失，其發(fā)病的機(jī)理更類似于神經(jīng)的支配作用消失，因此，研究神經(jīng)支配作用減退引起的大便失禁機(jī)制的臨床意義更加重要，而且神經(jīng)離斷后具有不可再生性，使得神經(jīng)損傷的失禁模型維持時間相對較長、模型較穩(wěn)定。但是，切斷神經(jīng)的造模方法因其尋找相關(guān)神經(jīng)較為困難，大鼠體型小，局部的視野暴露不充分，需要實驗員具有較好的解剖學(xué)和外科基礎(chǔ)，且大鼠神經(jīng)離斷后具有自愈的可能性，造模后模型的驗證方法，這些都是困擾和阻礙動物實驗研究的難點。因此，隨著大便失禁的機(jī)理研究的深入，更多、更好的大便失禁動物模型的造模方法將不斷涌現(xiàn)。

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