松樹抗松材線蟲病機制研究進展

邱秀文，何龍喜

(1.九江學(xué)院鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟研究中心，江西 九江 332005； 2.江西省林業(yè)有害生物防治檢疫局，江西 南昌 330038)

松材線蟲病(Pine wilt disease)是由松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus引起松屬Pinus樹種毀滅性死亡的一種世界性森林病害。由于該病害具有傳播速度快，致死率高，防治難度大，生態(tài)損失重等特點，被稱為“松樹的癌癥”。該病害在原產(chǎn)地北美洲未對松樹造成嚴(yán)重危害，而在傳入地中國、日本、韓國、葡萄牙和西班牙卻導(dǎo)致大量松樹感病死亡，給國民經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。近年來，很多學(xué)者對松材線蟲及其相似種的形態(tài)結(jié)構(gòu)、致病力差異、繁殖力差異、基因組以及致病相關(guān)基因等進行了大量研究，以期闡述松材線蟲病致病機理[4-9]。但目前有關(guān)松材線蟲病致病機理仍然不清楚，這給防治工作帶來了巨大困難。有學(xué)者從松樹與松材線蟲互作關(guān)系出發(fā)，對松材線蟲侵入后寄主細(xì)胞的生理生化響應(yīng)、次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和組織病理學(xué)變化等進行了研究，認(rèn)為寄主抗病反應(yīng)所產(chǎn)生的特異性次生代謝物質(zhì)可能是致病因子或促進了松樹的死亡[10-13]。松材線蟲病是松樹與松材線蟲互作后，線蟲突破寄主的防御系統(tǒng)，最終導(dǎo)致松樹整株感病死亡[12-14]。因此，研究松樹抗松材線蟲機制，對闡述松材線蟲病的致病機理和開展松材線蟲病可持續(xù)性防控具有重要的意義。

1 松樹與松材線蟲互作中的組織病理學(xué)研究

松樹感染松材線蟲后的癥狀發(fā)展被劃分為早期和后期兩個階段[14-15]。在感染松材線蟲早期，松樹接種點附近的皮層細(xì)胞和部分木質(zhì)部射線細(xì)胞被破壞，松樹樹脂減少或停止分泌，樹脂道周圍的薄壁細(xì)胞開始降解，這種生理和組織病變隨著線蟲在寄主體內(nèi)迅速擴散而擴展到整個植株[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)感染松材線蟲的黑松Pinusthunbergii薄壁細(xì)胞中的液泡變大[17]。但是，用無毒的擬松材線蟲Bursaphelenchusmucronatus接種黑松后，薄壁細(xì)胞液泡脹大的現(xiàn)象僅出現(xiàn)在接種點周圍的有限區(qū)域內(nèi)[17]。在病害發(fā)展的后期，松樹薄壁細(xì)胞的死亡和表皮、韌皮部、形成層的降解擴展到整個植株，同時伴隨著蒸騰作用的減弱和水分疏導(dǎo)受阻，最終導(dǎo)致松樹死亡[6]。松樹細(xì)胞膜脂的過氧化水平能表征細(xì)胞膜的傷害程度，其經(jīng)常在抗、感病反應(yīng)中增加。通過組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)寄主的部分薄壁細(xì)胞壞死時，膜脂過氧化反應(yīng)逐漸發(fā)生，且氧化水平的增加與細(xì)胞的降解、壞死及線蟲的繁殖同時進行。可見，松樹在感染松材線蟲病后，薄壁細(xì)胞隨著線蟲在寄主體內(nèi)遷移而不斷死亡，樹脂道遭到破壞，樹脂分泌停止，蒸騰作用減少等是松樹感染松材線蟲病的重要病理學(xué)特征。

2 松樹抗松材線蟲入侵的生理生化響應(yīng)研究

2.1 松樹抗病反應(yīng)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究 有研究表明松樹組織的壞死或過敏性死亡(HR)是寄主與松材線蟲互作過程中的一些信號分子誘導(dǎo)產(chǎn)生的[11-13]。在松樹感病早期，其體內(nèi)乙烯含量的增加被認(rèn)為是松樹抗病反應(yīng)中的重要信號[17]。在不同抗性的松樹中，乙烯的產(chǎn)生與松樹抗病機制之間的關(guān)系存在差異。乙烯在高抗的火炬松P.taeda及抗性選育存活的黑松和赤松P.densiflora中，產(chǎn)生時間較易感病的松樹早，且易感病松樹感染松材線蟲后，乙烯的產(chǎn)生先是立即減少，隨著線蟲的增殖而大量產(chǎn)生，最后導(dǎo)致植株死亡[18-21]?；鹁嫠山臃N松材線蟲后，其體內(nèi)乙烯出現(xiàn)暫時積累和部分管胞空穴化；而喬松P.griffithii感病后盡管出現(xiàn)了乙烯積累，但幾乎找不到管胞空穴化的出現(xiàn)[17,19]。這表明乙烯在火炬松和喬松抗病反應(yīng)中的作用機制存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)用弱毒的松材線蟲接種松樹后，并未導(dǎo)致乙烯的產(chǎn)生；而在接種弱毒松材線蟲又受水分脅迫的松樹中，乙烯的釋放更快速，且產(chǎn)生量更多[6]。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲分泌的纖維素酶、果膠酶等誘導(dǎo)了松樹中乙烯的釋放[6，17]，這表明松樹體內(nèi)乙烯產(chǎn)生的強度高低與松材線蟲的致病力和環(huán)境脅迫關(guān)系密切。松樹在感染松材線蟲早期，隨著細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)增加，薄壁細(xì)胞壞死數(shù)量增多[19]?；钚匝?ROS)、一氧化氮(NO)等在松樹感病早期細(xì)胞膜脂出現(xiàn)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)含物泄漏之前大量產(chǎn)生，而這些化學(xué)分子是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要信號物質(zhì)[11-13]。有研究表明火炬松、馬尾松P.massoniana和黑松感染松材線蟲后，活性氧和NO變化存在差異，與松樹的抗性和病程的發(fā)展密切相關(guān)[11-13]。由上可知，乙烯、活性氧、NO等是松樹抵御松材線蟲入侵的重要信號分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)了寄主的抗病反應(yīng)。但是，有關(guān)松樹與松材線蟲互作中信號分子關(guān)聯(lián)性研究，以及其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究報導(dǎo)較少，還不能全面揭示松樹抗松材線蟲機理。

2.2 松樹抗病反應(yīng)中的大分子化合物研究 松樹感染松材線蟲后，其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和酶活性的變化也是松材線蟲病的重要生理生化特征[22-23]。在感病早期，松樹體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、過氧化物酶活性、酚類氧化酶活性等明顯增加，膜脂也開始氧化[23]。同時，松樹體內(nèi)的糖類物質(zhì)濃度顯著下降，其有關(guān)次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生和酶活性增加的反應(yīng)開始出現(xiàn)[22]。因此，松樹體內(nèi)糖類物質(zhì)含量的降低可能是由其感染松材線蟲后呼吸作用的加強所導(dǎo)致的，但是這種呼吸作用的加強和能量產(chǎn)生的增加是脫離的，從而導(dǎo)致形成層細(xì)胞分裂明顯減少，松樹生長量減少。有研究發(fā)現(xiàn)健康的火炬松、硬葉松P.rigida體內(nèi)含有一種可溶解于水的化合物，其活性可抑制松材線蟲的擴展，且這種物質(zhì)的活性會因松材線蟲或無毒的擬松材線蟲誘導(dǎo)而增強[14,23]。有研究表明馬尾松種源體內(nèi)的游離氨基酸含量高低與抗松材線蟲能力呈負(fù)相關(guān)[20]?？梢?，不同的松種其抗病機制存在差異，有的松樹可能存在固有的抗病物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，有的可能需要病原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性。有研究表明在松材線蟲大量繁殖之前，隨著感病松樹體內(nèi)薄壁細(xì)胞中液泡的擴展，丹寧酸的含量也不斷增加。但是在線蟲繁殖盛期及松樹萎蔫癥狀出現(xiàn)時，卻未發(fā)現(xiàn)大量的丹寧酸[19,21]。而用無毒的擬松材線蟲接種黑松，卻沒有發(fā)現(xiàn)丹寧酸的含量發(fā)生顯著變化[20]。由此可見，丹寧酸的產(chǎn)生是松樹感染松材線蟲病程度高低的重要生理生化指標(biāo)?，F(xiàn)已證實松材線蟲能分泌許多大分子化合物，如纖維素酶、果膠酶、過氧化氫酶、蛋白酶和淀粉酶等。松材線蟲病的病理反應(yīng)可能是由一種或幾種大分子化合物主導(dǎo),也有可能是由多種大分子化合物共同參與作用的結(jié)果。

2.3 松樹抗病反應(yīng)中產(chǎn)生的植物毒素研究 許多研究表明，受害松樹木質(zhì)部薄壁細(xì)胞和樹脂道薄壁細(xì)胞在松材線蟲到達之前就發(fā)生了病變和死亡，并認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與松樹感病后產(chǎn)生的異常代謝物質(zhì)有關(guān)[27-28]。Oku首先提出松材線蟲發(fā)病可能涉及植物保衛(wèi)毒素[22]。自20世紀(jì)80年代以來，研究者先后從感染松材線蟲的松樹體內(nèi)分離到苯甲酸(BA)、兒茶酚(CA)、8-羥基香芹軟酮(8-HCA)、二氫松柏醇(DCA)和10-羥基馬鞭烯酮(10-HV)、苯乙酸(PA)和2-甲氧基肉桂酸等植物毒素，并證明這些毒素與松樹萎蔫有直接關(guān)系[8]。BA、CA對松樹的毒性比DCA、PA和8-HCA強[8]。這些有毒物質(zhì)主要是在松樹抵抗松材線蟲入侵過程中產(chǎn)生的一些次生代謝物質(zhì)。Zhang等對抗性和易感病黑松分別接種松材線蟲后的代謝物進行了分析比較，發(fā)現(xiàn)在線蟲增殖階段，亞油酸(LA)在抗性黑松中的含量是易感病黑松品種的2倍；苯甲酸在抗性黑松中含量很低，但在易感病的品種中則隨著線蟲數(shù)量的快速增加而迅速積累[26]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)在感病黑松中內(nèi)源殺線蟲物質(zhì)銀松素和銀松素甲基謎顯著高于抗性品種[26]。有研究表明在樟子松P.sylvestnis接種松材線蟲后，其體內(nèi)具有殺線蟲作用的脫氫松香含量增加，而在健康的樟子松中含量豐富的松香酸卻沒有殺線蟲活性[27]。這暗示松材線蟲可誘導(dǎo)松樹產(chǎn)生一些植物毒素，抵御線蟲入侵，但是過多的植物毒素積累會對自身細(xì)胞組織造成傷害。因此，松樹產(chǎn)生植物毒素的代謝途徑可能是松樹抗病的重要機制。隨著研究的不斷深入，更多的毒素將會被分離和鑒定，究竟是哪一種毒素在松樹萎蔫過程中起主導(dǎo)作用及相關(guān)作用機制仍然不清楚。

3 松樹抗松材線蟲病分子生物學(xué)研究

近年來，有關(guān)松樹抗松材線蟲病的分子生物學(xué)機理研究成為熱點，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)了一些與松樹抗病相關(guān)的基因。Kuroda等對不同抗性赤松接種松材線蟲后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行了分析，發(fā)現(xiàn)ESTs基因序列在抗性赤松中較感病的更豐富，認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于松材線蟲誘導(dǎo)了抗性赤松的相關(guān)抗性基因的表達，而在易感病的品種中抗性基因表達受到了一定的抑制，或者是抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到了阻礙，導(dǎo)致ESTs基因序列較少[29]。同時，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類、酚類化合物合成相關(guān)基因在抗性松樹中表達明顯高于感病松樹；一些病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)在感病赤松上出現(xiàn)了上調(diào)表達，而在抗性品種中未被發(fā)現(xiàn)[29]。Nose等對抗、感病的黑松接種松材線蟲后的基因表達進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)抗性黑松品種在接種線蟲后，PR-2、PR-4、滲調(diào)蛋白、脂肪氧合酶、查爾酮合酶等蛋白基因表達出現(xiàn)了明顯上調(diào)；過氧化物酶、水解酶相關(guān)基因在抗性品種中較易感病的上調(diào)表達更顯著[30]。這些差異表達的基因可能反映了抗性和易感病黑松對松材線蟲的抗性差異[30]。Xu等對馬尾松感染松材線蟲早期的基因表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)接種72 h后，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因開始出現(xiàn)高表達，馬尾松樹體內(nèi)的水解酶基因表達較豐富，而解毒相關(guān)基因和氧化還原酶基因表達較少[31]。這些與松樹抗松材線蟲相關(guān)的分子生物學(xué)研究為尋找抗性基因，并通過基因克隆和基因融合技術(shù)應(yīng)用于抗性育種，奠定了理論基礎(chǔ)，也為闡明松材線蟲分子致病機理提供了參考。

4 松樹抗病反應(yīng)對松材線蟲擴展和繁殖的影響

研究松樹對松材線蟲的抗病反應(yīng)是闡釋松樹抗病機制的重要途徑。松樹的抗病反應(yīng)不僅可以阻礙松材線蟲在松樹體內(nèi)迅速擴展，而且能抑制線蟲在寄主體內(nèi)迅速繁殖，從而延緩松材線蟲病的發(fā)展。有研究表明松材線蟲在火炬松體內(nèi)的移動速度較感病的黑松慢。但是不管在抗性松樹還是易感松樹中，線蟲仍能分布到整個松樹體內(nèi)[3]。有研究表明松材線蟲很難侵入火炬松的組織，即使侵入也不能馬上增殖；但能侵入抗病的喬松、感病的黑松和赤松組織[3,19]。并且研究發(fā)現(xiàn)在喬松感染松材線蟲的早期和擴展期的組織形態(tài)學(xué)存在著明顯的不同[3,19]，這種差異與喬松接種松材線蟲后的動態(tài)防衛(wèi)反應(yīng)較一致。Zhang 等比較分析了接種2周至1個月后的抗性黑松和感病黑松體內(nèi)的松材線蟲數(shù)量，發(fā)現(xiàn)線蟲在感病黑松體內(nèi)迅速增殖，而在抗性黑松中增殖較慢[26]。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲剛侵入喬松時遷移速度較在火炬松中快，這可能是因為在火炬松中本來就存在著某些抵抗松材線蟲入侵的物質(zhì)；而喬松在松材線蟲誘導(dǎo)下才產(chǎn)生大量的植保素，以致線蟲數(shù)量下降，甚至被消滅[3]。結(jié)構(gòu)性抗病方面，在健康的火炬松中觀察到，其能阻礙線蟲的移動并抑制線蟲的繁殖。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲能在死亡的火炬松中繁殖，這表明抗性松樹的抗病性只有在其健康狀態(tài)下才表現(xiàn)明顯。另外，通過離體的松樹枝條試驗，發(fā)現(xiàn)在沒有提供足夠營養(yǎng)和能量的條件下，松樹對松材線蟲的防御反應(yīng)會長時間癱瘓。黑松針葉的去除和對其進行光反應(yīng)的抑制處理能夠使弱毒松材線蟲和擬松材線蟲在黑松體內(nèi)繁殖，并最終導(dǎo)致黑松死亡[21-22]。同時，也有研究表明水分脅迫也能加速松材線蟲病的發(fā)展[17]。因此，松材線蟲入侵松樹后遷移和繁殖與松樹的結(jié)構(gòu)性抗病和誘導(dǎo)性抗病密切相關(guān)，同時也受環(huán)境因素的影響。篩選結(jié)構(gòu)性抗性基因?qū)剐杂N具有重要的意義。

5 總結(jié)

松樹體內(nèi)存在許多抵御松材線蟲入侵的相關(guān)因子，并且不同松種的抗病機制可能存在差異。松樹在感染松材線蟲后，其體內(nèi)的生理生化反應(yīng)如乙烯的產(chǎn)生、丹寧酸的積累、膜脂過氧化反應(yīng)、過氧化物酶活性增加和呼吸作用增強等不是同時產(chǎn)生的，而是在一系列的反應(yīng)中相互替代而相互聯(lián)系的。這些反應(yīng)都是松樹抵御松材線蟲入侵的生理生化響應(yīng)，且相互替代導(dǎo)致了松材線蟲病的不斷擴展，加速了松樹感病死亡。因此，上述相關(guān)松材線蟲病中的生化反應(yīng)可能是松材線蟲病致病機理的重要組成部分。但是，目前的研究往往只關(guān)注于松樹抗病反應(yīng)中某一方面的因子，對各因子之間的聯(lián)系研究較少。另外，松材線蟲入侵松樹后，對寄主與線蟲互作方面的研究也不夠深入，有些抗病反應(yīng)遠(yuǎn)比現(xiàn)在已認(rèn)識到的復(fù)雜。同時，闡釋寄主抗病反應(yīng)的機理在選育抗性的松樹品種和家系中具有重要的指導(dǎo)作用。因此，要加強有關(guān)松樹與松材線蟲互作后的反應(yīng)及其分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究，并把不同的生理生化反應(yīng)和代謝途徑聯(lián)系起來，闡明松樹抗病反應(yīng)中的信號分子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些研究對闡述松材線蟲病的致病機制和松樹的抗病機制以及指導(dǎo)抗性育種工程的實施都具有重要的意義。