豬瘟膠體金免疫快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

梅建國 ，莊金秋 ，張 穎 ，馬 力 ，李 峰

（1. 濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東 濱州 256600；2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。加強(qiáng)CSFV檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)預(yù)防和控制本病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。膠體金免疫技術(shù)是在膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，目前在動(dòng)物醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面主要有斑點(diǎn)免疫金滲濾法（Dot-immuogold filtration assay，DIGFA）和膠體金免疫層析技術(shù)（Gold immunochromatography assay，GICA）。這兩種檢測(cè)方法均具有操作簡便、快速、無污染、不需特殊儀器、特異性強(qiáng)、敏感性高、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)[1]。膠體金免疫技術(shù)在豬瘟疫病快速診斷、大批量檢測(cè)、大面積普查等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，受到了基層獸醫(yī)人員的青睞，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景[2]。本文概述了膠體金免疫技術(shù)在豬瘟抗原及抗體快速檢測(cè)上的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為豬瘟的有效防控提供參考。

1　膠體金免疫技術(shù)原理

膠體金免疫技術(shù)是繼20世紀(jì)80年代三大標(biāo)記技術(shù)（熒光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來的一種新型標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，對(duì)抗原（或抗體）物質(zhì)進(jìn)行定性、半定量乃至定量研究的一種新型體外快速免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[3]。

2　基于膠體金免疫技術(shù)的豬瘟檢測(cè)方法

2.1 豬瘟抗原檢測(cè)

陳龍賓等[4]采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金，選擇15 nm膠體金標(biāo)記兔抗CSFV多克隆抗體，對(duì)膠體金標(biāo)記抗體采用低溫超速離心法進(jìn)行純化，在硝酸纖維素膜的不同位置分別包被羊抗兔IgG（質(zhì)控線）和兔抗CSFV多抗IgG（檢測(cè)線），研制出可檢測(cè)CSFV的免疫層析試紙條。應(yīng)用該法及直接豬瘟熒光抗體試驗(yàn)、RT-PCR試驗(yàn)同時(shí)對(duì)豬瘟可疑病料進(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率分別為36.4%、45.5%和72.7%，雖然陽性檢出率較后兩者低，但該法操作簡便、耗時(shí)短，可用于豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查，更易于在基層推廣和應(yīng)用。張長弓等[5]應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，在玻璃纖維膜、硝酸纖維膜的檢測(cè)線（T）和對(duì)照線（C）上分別噴上膠體金與CSFV單克隆抗體（Ab2）的偶聯(lián)物、Ab2和羊抗鼠IgG多克隆抗體，制成檢測(cè)CSFV的膠體金快速檢測(cè)試紙。用該試紙檢測(cè)豬瘟弱毒活疫苗和豬瘟脾淋弱毒苗均顯陽性，而對(duì)豬源性的其他病毒、細(xì)菌抗原均顯陰性。楊明等[6]采用檸檬酸鈉還原法制備膠體顆粒，用膠體金標(biāo)記CSFV特異性單克隆抗體，將純化的CSFV抗體和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，研制檢測(cè)CSFV的快速診斷試紙條。用該試紙條檢測(cè)了70份臨床待檢樣品，與病毒分離鑒定的符合率為92.8%。付連軍等[7]采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金，選擇15 nm膠體金標(biāo)記兔抗CSFV純化后的多抗，組裝免疫層析試紙條，用試紙條和熒光抗體試驗(yàn)同時(shí)對(duì)8份豬瘟可疑病料進(jìn)行檢測(cè)，陽性符合率為83%。張露露[8]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記純化的抗CSFV E0單克隆抗體E01作為捕捉抗體，將純化的抗CSFV E0單克隆抗體E02和羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備了雙抗夾心法CSFV膠體金免疫層析試紙條，可檢測(cè)出純化的CSFV，并有明顯顯色。

2.2 豬瘟抗體檢測(cè)

斑點(diǎn)免疫金滲濾法微量、特異、敏感可靠、檢測(cè)時(shí)間短、效果直觀、非常適用于豬瘟的早期診斷、普查及疫苗免疫后抗體水平的檢測(cè)[9]?？追钡碌萚10]以CSFV包被硝酸纖維素膜，通過膠體金標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）直接顯色，陽性者出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，建立了檢測(cè)CSFV抗體的斑點(diǎn)免疫金滲濾法。整個(gè)試驗(yàn)過程僅需5 min，操作簡單。應(yīng)用該方法與Dot-ELISA、間接血凝試驗(yàn)（IHA）同時(shí)對(duì)200份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，與二者的符合率分別達(dá)98.4%和98.9%。王榮等[11]在單重斑點(diǎn)免疫金滲濾法的基礎(chǔ)上，將提純的CSFV和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗原同時(shí)包被在硝酸纖維膜素上，利用膠體金標(biāo)記SPA顯色，建立了能同時(shí)檢測(cè)CSFV和PRRSV兩種抗體的雙重斑點(diǎn)免疫金滲濾法，特異性高、重復(fù)性好，大大提高了檢測(cè)效率。陳善真等[12]利用人工篩選合成的CSFV多肽和PRRSV多肽葡聚糖偶聯(lián)物作為包被抗原，以多肽—Biotin－鏈霉親和素作為膠體金標(biāo)記物，羊抗豬IgG包被硝酸纖維素膜作為質(zhì)控帶，建立了一種同時(shí)檢測(cè)CSFV和PRRSV抗體的雙抗原夾心膠體金免疫層析方法。與IDEXX ELISA試劑盒平行檢測(cè)CSFV抗體總體符合率為86.36%；PRRSV抗體總體符合率為83.33%。本方法的建立可為多肽抗原在畜禽疾病診斷方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。由于CSFV分離、培養(yǎng)、純化較困難，用基因工程技術(shù)來體外重組表達(dá)CSFV保護(hù)性抗原基因的E2蛋白，用該蛋白或其單抗做金標(biāo)抗原或抗體，可避免純化病毒的麻煩。王麗等[13]利用基因工程方法將CSFV C株Erns和E2基因主要抗原域連接后在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，獲得嵌合蛋白CnC2，將純化后的嵌合蛋白進(jìn)行膠體金標(biāo)記，并在硝酸纖維素膜上包被抗CnC2單克隆抗體，建立了檢測(cè)豬瘟抗體的免疫層析試紙條，敏感性和特異性分別高達(dá)97%和100%，非常適合豬瘟抗體滴度的臨床檢測(cè)和調(diào)查。尹梅[14]將CSFV重組E2蛋白標(biāo)記膠體金作為捕捉抗原，純化CSFV E2蛋白和兔抗E2多克隆抗體包被在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，特建立了檢測(cè)CSFV抗體的雙抗原夾心膠體金免疫層析試紙條方法。應(yīng)用該試紙條和IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)來自江蘇太湖和浦口的共計(jì)80份血清樣品，兩種檢測(cè)方法的符合率為90.3%，取得了理想的檢測(cè)效果。

2.3 豬瘟強(qiáng)、弱毒鑒別檢測(cè)

CSFV E2蛋白能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在不同毒株間高度保守，是CSFV最重要的保護(hù)性抗原，可用于建立豬瘟血清學(xué)檢測(cè)方法。劉暢等[15]、鄭鳴等[16]、王慧杰等[17]、李華瑋等[18]先后以豬瘟兔化弱毒E2基因表達(dá)后的純化蛋白為弱毒抗原，以PK-15細(xì)胞培養(yǎng)純化后的豬瘟病毒強(qiáng)毒為強(qiáng)毒抗原進(jìn)行膠體金標(biāo)記，運(yùn)用雙抗原夾心法建立了能區(qū)分豬瘟強(qiáng)、弱毒的檢測(cè)豬瘟抗體的免疫層析試紙條方法。夏照和[19]采用環(huán)磷酰胺免疫抑制法，用純化的桿狀病毒表達(dá)的豬瘟疫苗株（HCLV株）E2蛋白作為耐受原，石門株E2蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得抗E2蛋白單克隆抗體。該單克隆抗體可以用于鑒別豬瘟野毒株和豬瘟兔化弱毒疫苗株，為研究豬瘟強(qiáng)毒和弱毒之間的分子差異奠定了基礎(chǔ)。王向鵬等[20]利用CSFV E2蛋白的單克隆抗體為捕捉抗體，建立了快速、簡便的檢測(cè)CSFV野毒的膠體金免疫層析方法。其檢出病毒培養(yǎng)物的最低檢測(cè)限為103.5TCID50，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，初步達(dá)到了區(qū)分檢測(cè)CSFV野毒株和弱毒株的目的。彭伍平等[21]利用桿狀病毒表達(dá)了CSFV石門株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白，以石門株E2蛋白為免疫原免疫小鼠，制備了一株抗CSFV石門株E2蛋白的單抗（McAb）6E10，該單抗與兔化弱毒疫苗株不反應(yīng)。王向鵬[22]在此基礎(chǔ)上又以純化的McAb 6E10標(biāo)記膠體金顆粒，研制出快速、簡便檢測(cè)CSFV野毒的膠體金免疫層析試紙條，達(dá)到了區(qū)分檢測(cè)CSFV野毒株和弱毒株的目的。

3　豬瘟膠體金免疫技術(shù)與其他檢測(cè)方法的比較

3.1 豬瘟抗原檢測(cè)

王向鵬等[23]系統(tǒng)比較了檢測(cè)CSFV的6種方法，結(jié)果表明RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其靈敏性高，可作為首選檢測(cè)方法，但操作時(shí)需要避免假陽性的出現(xiàn)；病毒分離雖然操作繁瑣，但結(jié)果準(zhǔn)確，是確診豬瘟必不可少的檢測(cè)方法；抗原捕捉ELISA和膠體金試紙條檢測(cè)時(shí)間較短，但敏感性較低。張艷英等[24]應(yīng)用RT-nPCR、熒光抗體法、膠體金免疫層析試紙條3種方法，分別對(duì)30份疑似豬瘟病料中的CSFV進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果RT-nPCR方法檢出陽性樣品11份，熒光抗體法13份，膠體金免疫層析試紙條8份；3種方法檢測(cè)全為陽性8份，全為陰性17份。結(jié)果表明，RT-nPCR具有快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，但需一定儀器設(shè)備及成熟的方法；熒光抗體法所需時(shí)間較短，但需要經(jīng)驗(yàn)豐富人員判定結(jié)果，且存在假陽性結(jié)果，敏感性較差；膠體金免疫層析試紙條方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是簡便快速，且適合基層的應(yīng)用，不足之處就是敏感性較低。

3.2 豬瘟抗體檢測(cè)

金顏輝等[25]用金標(biāo)免疫層析技術(shù)檢測(cè)30份豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和18份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，結(jié)果陽性、陰性符合率均為100%。同時(shí)采用GICA、間接ELISA、Dot-ELISA、IHA平行檢測(cè)205份血清樣品，間接ELISA陽性率86.8%、GICA陽性率85.4%、Dot-ELISA陽性率81.5%、IHA陽性率58.5%。向林遠(yuǎn)等[26]用GICA和ELISA平行檢測(cè)豬血清抗體滴度，二者符合率為86.6%，用GICA檢測(cè)豬瘟抗體滴度存在一定程度的漏檢率及誤診率，只能初步篩查豬瘟抗體，GICA篩查陰性的豬血樣應(yīng)再用ELISA法復(fù)檢以防漏檢。邢東義等[27]對(duì)西藏林芝地區(qū)某縣采集的92個(gè)疑似豬瘟樣品應(yīng)用膠體金免疫層析法與ELISA法檢測(cè)豬瘟抗體和抗原，結(jié)果表明，豬瘟膠體金法抗原和抗體檢測(cè)陽性符合率為100%，ELISA法檢測(cè)的陽性符合率為95%以上。宋忠旭等[28]也進(jìn)行了膠體金免疫層析試紙條與ELISA檢測(cè)豬瘟抗體的比對(duì)試驗(yàn)。結(jié)果膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)豬瘟抗體陽性檢出率94.69%，ELISA法檢測(cè)豬瘟抗體合格率95.58%，兩者符合率為99.07%。這兩種方法操作方便、快速，適合于臨床快速檢測(cè)和疫病普查中高通量樣品的篩查。

4　小結(jié)與展望

豬瘟的檢測(cè)方法較多，主要包括病毒分離鑒定、分子生物學(xué)及血清學(xué)方法。各種檢測(cè)方法均具有一定的優(yōu)缺點(diǎn)和局限性，各實(shí)驗(yàn)室和廣大養(yǎng)殖戶可根據(jù)自身?xiàng)l件選擇一種或多種方法聯(lián)合應(yīng)用[29]。膠體金免疫技術(shù)具有簡便、快速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別適合廣大基層獸醫(yī)人員進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)和大面積動(dòng)物疫病普查等應(yīng)用，是當(dāng)前豬瘟檢測(cè)方法中簡單、快速、敏感的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的發(fā)展?jié)摿30]。相信隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、豬瘟病毒研究的不斷深入及膠體金免疫技術(shù)的不斷完善，相信豬瘟膠體金免疫技術(shù)將不斷走向成熟，逐漸實(shí)現(xiàn)抗原抗體的多元、定量或半定量檢測(cè)。

[1] 李嬌，謝金文，唐娜，等. 豬瘟病毒常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法概述[J]. 養(yǎng)豬，2013（3）：97-101.

[2] 陳劍閣. 膠體金免疫技術(shù)在豬瘟診斷上的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國動(dòng)物保健，2011，13（6）：14-15.

[3] 劉賀，于丹. 豬瘟檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 畜禽業(yè)，2016（8）：12-15.

[4] 陳龍賓，王愛華，蘇小庚，等. 豬瘟病毒膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（6）：496-499.

[5] 張長弓，黃印堯，鄭海明，等. 豬瘟病毒抗原膠體金快速檢測(cè)試紙的研究[J].福建畜牧獸醫(yī)，2007，29（6）：1-3.

[6] 楊明，陳伯祥，孫曉林，等. 豬瘟膠體金快速診斷試紙條的研制[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（2）：34-37.

[7] 付連軍，姜成，李沐森. 豬瘟快速診斷金標(biāo)試紙條的研制及應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志，2011，30（3）：17-19.

[8] 張露露. 豬瘟病毒E0蛋白單克隆抗體的制備及其膠體金免疫層析檢測(cè)方法的初步探索[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] 李嬌，王金良，沈志強(qiáng). 豬瘟抗體的幾種常用檢測(cè)方法概 述[J]. 養(yǎng)豬，2013（6）：126-128.

[10] 孔繁德，黃印堯，賴清金，等. 斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)豬瘟抗體的研究[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2003（11）：31-33.

[11] 王榮，孔繁德，吳德峰，等. 斑點(diǎn)免疫金滲濾法同時(shí)檢測(cè)豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征抗體的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（1）：107-111.

[12] 陳善真，林禮錕，王志花，等. 利用多肽抗原建立同時(shí)檢測(cè)CSFV和PRRSV抗體的膠體金免疫層析方法[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（11）：1-5.

[13] 王麗，李學(xué)伍，騰蔓，等. 豬瘟病毒C株Erns/E2嵌合基因表達(dá)蛋白單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性的鑒定[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25（12）：1126-1129.

[14] 尹梅. 豬瘟病毒抗體膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[15] 劉暢，鄭鳴，潘春梅. 膠體金免疫層析法在豬瘟強(qiáng)、弱毒抗體檢測(cè)上的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，39（4）：59-63.

[16] 鄭鳴，金彥法，閆國慶. 利用膠體金免疫層析法檢測(cè)豬瘟強(qiáng)、弱毒抗體方法的建立[J]. 鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2006，26（2）：1-4.

[17] 王慧杰，寧豫昌. 豬瘟膠體金免疫層析快速診斷法的建立及應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（6）：61-64.

[18] 李華瑋，鄭鳴. 膠體金免疫層析法檢測(cè)豬瘟（強(qiáng)弱毒區(qū)分）抗體研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（7）：130-132.

[19] 夏照和. 特異性識(shí)別豬瘟病毒野毒株的單克隆抗體制備[D].哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，2008.

[20] 王向鵬，孫元，楊增岐，等. 檢測(cè)豬瘟病毒野毒株膠體金免疫層析方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（6）：441-445.

[21] 彭伍平，夏照和，侯強(qiáng)，等. 豬瘟病毒石門強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位點(diǎn)差異分析[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2007，24（5）：389-393.

[22] 王向鵬. 豬瘟病毒野毒膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[23] 王向鵬，張興娟，孫元，等. 六種檢測(cè)豬瘟病毒方法的比較[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（8）：1087-1093.

[24] 張艷英，高桂生，高光平，等. 豬瘟病毒3種檢測(cè)方法的比較[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（3）：205-209.

[25] 金顏輝，黃印堯，張長弓，等. 應(yīng)用金免疫層析技術(shù)檢測(cè)豬瘟抗體的研究[J].中國動(dòng)物檢疫，2004，21（5）：26-27.

[26] 向林遠(yuǎn)，杜國芹. 膠體金法與ELISA法檢測(cè)豬瘟抗體結(jié)果對(duì)比分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)，2012（8）：4-5.

[27] 邢東義，王剛，格桑央珍，等. ELISA和膠體金法在豬瘟病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)，2014，44（7）：14-16.

[28] 宋忠旭，雷彬，李良華，等. 膠體金免疫層析試紙條與ELISA檢測(cè)豬瘟抗體的比對(duì)試驗(yàn)[J]. 養(yǎng)殖與飼料，2015（10）：4-5.

[29] 羅丹丹，謝晶，李興玉，等. 豬瘟膠體金快速診斷法的研究進(jìn)展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2014，41（2）：39-41.

[30] 姜成，李沐森，付連軍，等.豬瘟快速診斷金標(biāo)試紙條的研制及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2011，30（3）：17-19.