Wnt/β-catenin抑制劑DKK1調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

蘭維婭 唐 芳 馬武開 姚血明 盧向陽 陳琳英 李 宇

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫炎癥性疾病〔1〕。Wnt通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的各個功能，如生長、發(fā)育、增殖、分化和凋亡，同時參與調(diào)控成骨、軟骨、滑膜和關(guān)節(jié)生理學(xué)等多方面的代謝調(diào)節(jié)。隨著對Wnt信號通路的深入研究，發(fā)現(xiàn)此信號途徑在RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)異常激活和增殖、成骨/破骨細(xì)胞平衡失調(diào)、軟骨破壞和骨鈣流失中發(fā)揮著及其重要的作用〔2〕。近年來，內(nèi)源性Wnt通路的負(fù)調(diào)控蛋白如Dickkopf相關(guān)蛋白(DKK)1引起極大重視，這些負(fù)調(diào)控蛋白可作為調(diào)控Wnt信號通路的潛在治療靶點。本文就Wnt/β-catenin/DKK1在RA發(fā)病機制中的調(diào)控作用進行深入探討。

1 Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Wnt信號通路根據(jù)是否有β-catenin參與分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路，DKK1主要參與拮抗Wnt/β-catenin途徑。當(dāng)該途徑被激活，分泌的Wnt蛋白與質(zhì)膜上的卷曲蛋白(Fzd)在胞外區(qū)結(jié)合與低密度脂蛋白相關(guān)蛋白(LRP)5/6受體結(jié)合形成復(fù)合物，啟動和激活Wnt經(jīng)典信號通路。通過激活胞內(nèi)的蓬亂蛋白(Dvl)，與軸蛋白(Axin)、Frat-1形成降解復(fù)合體，抑制糖原合成激酶(GSK)-3β活性，引起底物β-catenin去磷酸化，累積的游離β-catenin 在胞質(zhì)中堆積，隨后進入細(xì)胞核，β-catenin中一級結(jié)構(gòu)的C末端取代轉(zhuǎn)錄抑制因子，繼而與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)-1結(jié)合形成三元復(fù)合物，通過刺激Wnt信號下游靶基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bmp)2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13等的轉(zhuǎn)錄，促進成骨細(xì)胞的分裂、增殖和成熟，同時影響著破骨細(xì)胞的分化與成熟〔3～5〕。

2 DKK1蛋白結(jié)構(gòu)及調(diào)控Wnt作用機制

2.1DKK1蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征 DKK是Glinka等〔6〕在1998年研究兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，在誘導(dǎo)胚胎頭頸形成的過程中發(fā)揮著重要作用。DKK基因編碼分泌型糖蛋白DKK1，基因全長1 815 kb，人類的DKK1結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能基因定位于第10號染色體 10q11上，由266個氨基酸組成，包括由31個氨基酸組成的N端信號肽段、2個半胱氨酸富集區(qū)及具有糖基化作用的C端，相對分子質(zhì)量為35。在脊椎動物中，DKK家族共有4種，DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，它們具有高度同源性，其中DKK1和DKK4能抑制Wnt信號通路，但DKK4稍弱，DKK2既能活化Wnt信號通路也能起拮抗作用，而DKK3對Wnt信號通路沒有明顯的影響〔7〕。

2.2DKK1對Wnt調(diào)控機制 Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號途徑和非經(jīng)典Wnt/JNK介導(dǎo)的Planer細(xì)胞極性途徑、Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、Wnt/平面細(xì)胞極性(PCP)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及Wnt/Rho途徑。DKK1主要參與Wnt/β-catenin經(jīng)典途徑，拮抗其信號通路的傳導(dǎo)。拮抗此信號通路機制主要以下兩個方面：一方面DKK1能夠在細(xì)胞外與Wnt蛋白輔助受體LRP5/6結(jié)合，此功能缺失突變表現(xiàn)為由骨形成降低所造成的骨量下降〔8〕；另一方面DKK1可通過與含有Kringle結(jié)構(gòu)域的Kremen受體(包括Kremen-1和Kremen-2)結(jié)合，并與LRP5/6形成DKK1-LRP-Kremen三聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生快速內(nèi)吞，形成內(nèi)吞小體，從細(xì)胞膜上除去LRP5/6，最終β-catenin被磷酸化而不能與核內(nèi)LEF/TCF結(jié)合，從而抑制 Wnt經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路〔9〕。

3 Wnt/DKK1對RA的調(diào)控

3.1Wnt信號通路調(diào)控骨代謝 當(dāng)缺乏Wnt蛋白時，Wnt通路未被啟動激活，上游基因β-catenin與結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(APC)、Axin和GSK-3β結(jié)合形成復(fù)合體，有利于酪蛋白激酶1和GSK3促進β-catenin磷酸化,這時Wnt信號通路的作用被抑制，影響成骨細(xì)胞的分裂、分化和成熟，導(dǎo)致骨形成不足。激活Wnt信號通路可以促進造骨細(xì)胞的骨保護素(OPG)表達(dá)上調(diào)，后者能夠抑制破骨細(xì)胞的分化而增加骨密度〔10〕。此外，Wnt信號通路組分基因被敲除(去卵巢小鼠)和通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鼠模型也證實了Wnt/β-catenin通路影響的分化潛能間充質(zhì)前體通過壓抑過氧化物酶增殖物受體(PPAR)γ和增加關(guān)鍵成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，引起成骨細(xì)胞的分化、復(fù)制或活動，影響骨基質(zhì)的形成及鈣化等，并可影響破骨細(xì)胞的發(fā)生和骨吸收，增加骨小梁的質(zhì)量和強度〔11,12〕。

3.2Wnt/DKK1對RA成骨細(xì)胞的調(diào)控 成骨細(xì)胞中Wnt經(jīng)典途徑的血清DKK1抑制劑表達(dá)增強，通過結(jié)合LRP5/6 受體來抑制其轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制成骨細(xì)胞活性，促進成骨細(xì)胞凋亡。Liu等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，成年RA患者，血清DKK1測定明顯增高，尤其在RA活動期,且DKK1在RA不同階段表達(dá)不同生理功能，據(jù)此猜測DKK1可能作為預(yù)測RA病情進展的新指標(biāo)。Daoussis等〔12〕發(fā)現(xiàn)，DKK1在RA系統(tǒng)疾病中發(fā)揮了重要作用，通過激活Wnt信號，引起下游一系列基因轉(zhuǎn)錄，且把DKK1作為骨量增減的調(diào)節(jié)器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化增加，同時間接影響破骨細(xì)胞的成熟，影響著骨代謝。上述這些研究說明，RA中骨重建和骨吸收的失衡可能是由于Wnt信號通路活動被DKK1結(jié)合LRP5/6 受體起拮抗作用而造成的。

Ke等〔13〕發(fā)現(xiàn)，RA動物模型中使DKK1分子表達(dá)減少可以提高成骨/破骨比例、促進骨重建。相反，Heiland等〔14〕則研究發(fā)現(xiàn)，一些炎癥因子可以通過激活和增加DKK1進一步加速骨丟失、促進骨破壞。給RA模型小鼠注射抗-DKK1抗體，檢測其成骨細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPG顯著增加，骨重塑被激活，表明在小白鼠體內(nèi)使用抗-DKK1藥物發(fā)生了活躍的骨重建〔15〕。Manara 等〔16〕等應(yīng)用腫瘤壞死因子(TNF)-α阻斷劑抑制 DKK1發(fā)現(xiàn)，RA患者的骨破壞逐漸可逆轉(zhuǎn)為骨重塑，改善患者關(guān)節(jié)功能，TNF-α作為DKK1的主要誘導(dǎo)劑，TNF-α阻斷劑能有效的阻斷DKK1的功能?？梢姡琖nt信號通路通過調(diào)控成骨細(xì)胞，增加骨形成，而其抑制劑DKK1表達(dá)增加，并與LRP5/6結(jié)合，降低β-catenin水平，使成骨細(xì)胞凋亡，減少骨形成和代謝。DKK1表達(dá)上調(diào)可能成為RA成骨細(xì)胞活性抑制的主要機制，而對于RA患者中成骨細(xì)胞的Wnt信號途徑中的其他變化或是成骨細(xì)胞的其他信號通路影響還可以做更深入的研究。

3.3Wnt/DKK1對RA破骨細(xì)胞的調(diào)控 目前Wnt/β-catenin信號通路對破骨細(xì)胞的調(diào)控研究較少，其影響大多是作用于成骨細(xì)胞的基礎(chǔ)上間接影響破骨細(xì)胞的功能。破骨細(xì)胞的Wnt/DKK1對RA的調(diào)控是通過影響RANKL-RANK-OPG 信號調(diào)節(jié)軸間接調(diào)控骨吸收發(fā)生的，其具體機制為：成骨細(xì)胞中Wnt信號途徑的抑制因子DKK1上調(diào)，降低OPG /核因子-κB受體活化素配體(RANKL)比值，從而促進破骨細(xì)胞分化增殖，引發(fā)關(guān)節(jié)障礙。OPG是一種分泌型細(xì)胞因子，其蛋白序列類似于核因子-κB 受體活化素受體(RANK)，因此它可以通過競爭性結(jié)合RANKL，從而抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟及破骨細(xì)胞的骨吸收作用，最終加速骨質(zhì)破壞〔17〕。

在某種情況下，誘導(dǎo)Wnt信號通路的DKK1表達(dá)增強，減少成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)及OPG表達(dá)，間接增加破骨細(xì)胞生成，有利于其分化，從而造成非正常的骨質(zhì)代謝；相反，DKK1阻斷Wnt/β-catenin信號通路會誘導(dǎo)破細(xì)胞增殖、促進骨吸收。Wang等〔18〕通過去卵巢鼠實驗發(fā)現(xiàn)，DKK1反義寡核苷酸處理組RANKL表達(dá)下降，抑制破骨細(xì)胞分化，進一步證實了DKK1通過抑制經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路使破骨細(xì)胞基質(zhì)形成和礦化減少，同時過表達(dá)DKK1的轉(zhuǎn)基因小鼠骨形成和骨量明顯減少。我們大膽猜想，通過應(yīng)用DKK1的中和抗體治療RA患者，可能起到阻斷DKK1的作用，從而抑制Wnt/β-catenin 信號通路，延緩和阻止關(guān)節(jié)畸形。

4 小 結(jié)

綜上所述，骨代謝過程中，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收保持著動態(tài)平衡，而DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，通過減少成骨細(xì)胞的數(shù)量，骨量減少，并且間接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，骨吸收加強。盡管DKK1抑制劑調(diào)控RA患者Wnt信號通路分子機制尚未闡明，但其阻止或延緩骨代謝疾病的發(fā)生及進程的積極作用是可以肯定的。由此得出，針對成骨、破骨細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號途徑抑制劑的抗DKK1抗體可能成為治療RA的新靶點。

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