三葉青遺傳資源與栽培技術(shù)研究進(jìn)展

梁君瑛，韓素芳，應(yīng)尚蛟，程詩(shī)明，徐 梁，張都海，張飛英，趙彩芳(1.浙江省航空護(hù)林管理站，浙江 杭州 10020； 2.永康市林業(yè)局，浙江 永康 0700； .浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 1002)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隸屬于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma),又名蛇附子、石抱子、石猴子、金線吊葫蘆等，是我國(guó)特有的民間藥用植物[1]。一般需要種植3～5年才能達(dá)到商品藥材的要求。以塊根或全草入藥，具有抗病毒、鎮(zhèn)痛與解熱、保肝等作用，毒副作用小，具有“植物抗生素”的美稱，臨床上已廣泛用于抗癌、抗腫瘤及抗艾滋病毒等[2]。不同產(chǎn)區(qū)、不同種質(zhì)三葉青的地下塊根產(chǎn)量及有效成分含量存在明顯差異，且人工栽培難度較大，因此，資源評(píng)價(jià)、品種選育和栽培技術(shù)研究是三葉青生產(chǎn)及應(yīng)用上亟待解決的重要課題。

1 遺傳資源

1.1 資源分布

三葉青對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，常生長(zhǎng)在陰濕的山坡、山溝、谷溪中，喜歡時(shí)隱時(shí)現(xiàn)的散光照射、濕潤(rùn)的氣候。對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，pH值5.0～7.0 的酸性至中性土壤均可生長(zhǎng)。怕炎夏高溫，通常氣溫在25 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，平均氣溫低于5～10 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)，忌強(qiáng)光暴曬，忌干旱。有極強(qiáng)的地域選擇性，水平分布為18°30′～32°20′N，垂直分布海拔為300～1 300 m，在我國(guó)福建、浙江、江西、廣西、廣東、海南、臺(tái)灣、云南、湖南等地均有發(fā)現(xiàn)，其中以廣西三葉青和浙江三葉青種類最多[3]。

1.2 資源形態(tài)

三葉青為多年生草質(zhì)攀緣藤本，藤莖細(xì)軟，卷須與葉對(duì)生，卷須以直行捆綁式使藤攀爬于其他植物上，較老藤形扁、表皮紫褐色，較嫩藤形圓、表皮青色，葉互生，一柄長(zhǎng)三葉，中葉稍大，葉呈卵狀披針形，邊緣有鋸齒，葉柄及葉片表面翠綠。每年5月開(kāi)花，至秋季末結(jié)果，漿果球狀，黃豆般大小，成熟后色澤鮮紅艷麗，掛果期長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。塊根形狀主要有紡錘形、卵圓形、葫蘆形或橢圓形，單個(gè)或數(shù)個(gè)相連呈串珠狀[4]。

1.3 種質(zhì)資源鑒定

朱波等[5]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)從浙江、江西、福建、廣西、湖南、湖北等三葉青主分布區(qū)收集的24份種質(zhì)資源進(jìn)行分析，用UPGMA法將其分成4大類，其中浙江種源為一組，江西、廣西、湖北、湖南為一組，湖南懷化與廣西鐘山為一組，貴州種質(zhì)單獨(dú)一組。表明ISSR分子標(biāo)記適用于三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析。從地理位置和相似系數(shù)分析，種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近不全由地理距離決定，生態(tài)氣候、地形地貌、海拔、經(jīng)緯度等自然因素及人類活動(dòng)等社會(huì)因素均會(huì)影響親緣關(guān)系。符淵淼[6]將DNA條碼技術(shù)應(yīng)用于三葉青及其近緣種的種質(zhì)鑒定，確定了ITS及rbcL+matK+ITS是鑒定三葉青和其他近緣種的最佳條碼。分子生物學(xué)技術(shù)在三葉青種質(zhì)鑒別中的應(yīng)用研究尚不成熟，今后應(yīng)加強(qiáng)種質(zhì)資源收集，并且加快建立適合三葉青種質(zhì)資源鑒別且使用可行的技術(shù)，以保護(hù)三葉青這一珍貴的藥用資源。

1.4 種質(zhì)資源評(píng)價(jià)

黃真等[7]對(duì)廣西三葉青和浙江三葉青塊根性狀進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示廣西三葉青個(gè)體較大，多數(shù)表面有皺紋，斷面粉紅色；而浙江三葉青個(gè)體較小，較圓整，光滑，斷面類白色。另外顯微鑒定顯示，兩者藥材性質(zhì)也不相同，兩者浸出液中都含有黃酮類化合物、多糖和氨基酸，但對(duì)具體成分及藥效差別尚未研究。鄭軍獻(xiàn)等[8]用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定廣西和浙江的共10個(gè)樣本，結(jié)果表明，浙江產(chǎn)三葉青的總黃酮含量高于廣西產(chǎn)，浙江產(chǎn)中又以建德種源最高，常山次之，天臺(tái)第三，蘭溪最低。范世明等[9]對(duì)采自福建福安、順昌、泰寧、福鼎、柘榮等地的三葉青進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，結(jié)果不同產(chǎn)地的三葉青塊根總黃酮含量存在明顯差異，其中福安和泰寧的三葉青總黃酮含量較高，且野生比人工栽培的總黃酮含量更高。楊雄志等[10]對(duì)分別在浙江樂(lè)清、舟山二地區(qū)和江西、福建、湖北、廣西等地采集的6個(gè)三葉青種源提取物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，浙江樂(lè)清和舟山的三葉青提取物在解熱和對(duì)5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量影響方面都占有明顯優(yōu)勢(shì)，這與鄭軍獻(xiàn)等[8]的測(cè)定結(jié)果基本一致。付金娥等[11]對(duì)浙江三葉青和廣西三葉青12種元素進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)除Zn、Cr、Pb外，其他9種元素浙江三葉青均高于廣西三葉青。目前，對(duì)不同種源三葉青有效成分含量并沒(méi)有系統(tǒng)的比較研究，從已有的研究可以看出，浙江種源三葉青從品質(zhì)、藥效上都屬于比較好的。浙江省三葉青又可分很多不同種源，它們之間的優(yōu)劣比較還有待進(jìn)一步的研究探討。

2 繁育技術(shù)

2.1 扦插繁殖

浦錦寶等[12]采用500 mg·L-1生根粉溶液浸泡插穗切口1 h，然后與地面成35°～45°斜插于砂壤土中，實(shí)現(xiàn)了三葉青的人工扦插繁殖。吉慶勇等[13]對(duì)三葉青扦插繁殖技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果用1 000 mg·L-1IBA浸漬2～3年生三葉青老枝插條10 s后扦插于黃土中的繁殖效果較好。利用扦插手段進(jìn)行三葉青繁殖操作比較簡(jiǎn)單，目前，浙江省多地都通過(guò)這種方法來(lái)進(jìn)行種苗繁育，多方比較顯示，扦插于裝有基質(zhì)的容器中的效果要好于直接扦插在土中的對(duì)照，但這種方法不適用于大批量的種苗繁育。

2.2 組培快繁

鐘毓倩[14]對(duì)三葉青不同部位(莖尖、帶腋芽的莖段和葉片)的外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，在相同的滅菌處理下和同種培養(yǎng)基中，莖尖為最佳誘導(dǎo)外植體，同時(shí)認(rèn)為MS+NAA 0.2 mg·L-1是最佳的增殖培養(yǎng)基。錢(qián)麗華等[15-16]均采用三葉青莖段腋芽為外植體實(shí)現(xiàn)了快速繁殖。邵駿驊等[17]以三葉青帶幼嫩腋芽莖段為外植體，成功建立了三葉青高效快繁技術(shù)體系，判定最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg·L-1。吳浩等[18]以不帶腋芽的莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，通過(guò)誘導(dǎo)組織脫分化形成不定芽，實(shí)現(xiàn)了三葉青人工繁殖，MS、B5培養(yǎng)基交替繼代方式有利于三葉青愈傷組織的繼代和分化。上述研究說(shuō)明，三葉青組培快繁技術(shù)已趨向成熟，規(guī)?；S化育苗已基本可以實(shí)現(xiàn)。

2.3 仿野生栽培

毛麗花[19]在果園和蔬菜棚架下，采用袋式栽培和直接種植的方式進(jìn)行三葉青栽培，發(fā)現(xiàn)袋式種植比大田和直接種植在地里的三葉青塊根更多，經(jīng)濟(jì)效益更明顯。結(jié)合浙江省各地三葉青林下栽培情況，認(rèn)為郁閉度為0.6以上，已采取墾復(fù)、撫育等較高強(qiáng)度經(jīng)營(yíng)管理措施的(半)常綠闊葉林、油茶林、香榧林等成齡林下，且土層厚度>30 cm，含腐殖質(zhì)豐富的偏酸性土壤，坡度<30°排澇較好的山坡地較適合種植三葉青。

為防止水土流失，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，提高產(chǎn)量，推薦以控根容器栽培為最佳。為了防止雜草，擺放控根容器區(qū)域林地實(shí)行帶墾或劈草后鋪設(shè)地膜?；|(zhì)配方為33%林地腐殖質(zhì)土或泥炭、16%紅壤，26%蛭石、8%珍珠巖、17%礱糠，堆漚發(fā)熱后才能使用。種植時(shí)間為每年的冬季和春季，要求隨起苗隨栽，避免苗根遭受風(fēng)吹和日曬。

本課題組近幾年來(lái)對(duì)三葉青栽培技術(shù)進(jìn)行研究，總結(jié)出一套包括選地、定植、田間管理、采收等在內(nèi)的規(guī)范化栽培技術(shù)。

選擇土質(zhì)疏松、肥沃、略呈酸性及排水良好的陰面山坡地，除草整地。選用苗高15～20 cm，帶有5～10條根的健壯種苗進(jìn)行定植。定植應(yīng)選在春季3月左右，此時(shí)日平均氣溫在10 ℃以上，地表溫度上升，無(wú)凍土，可有效防止低溫對(duì)種苗的傷害。定植時(shí)按株行距0.1 m×0.3 m種植，用手壓實(shí)并澆足定根水，使根系與土壤緊密結(jié)合。

期間應(yīng)注意田間管理工作，及時(shí)中耕除草，為種苗創(chuàng)造一個(gè)疏松、通風(fēng)的良好環(huán)境，并視土壤肥力情況適當(dāng)施肥。在進(jìn)行田間管理時(shí)，應(yīng)注意避免傷及種苗根系，適時(shí)培土防止根系外露影響產(chǎn)量。三葉青病蟲(chóng)害主要有葉斑病，可用65%代森鋅可濕性粉劑500～600倍液或1∶1∶150的波爾多液進(jìn)行防治。在仿野生栽培三葉青過(guò)程中遮蔭是關(guān)鍵，應(yīng)及時(shí)設(shè)置遮陽(yáng)網(wǎng)，遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔽程度為70%左右。

三葉青地上及地下部分的生長(zhǎng)主要集中在一年中的4—7月和9—11月，其他季節(jié)處于生長(zhǎng)緩慢或休眠狀態(tài)。而10月中旬至11月下旬三葉青進(jìn)入秋發(fā)期，此階段主要以地下塊莖的生長(zhǎng)為主，基本占到全年生長(zhǎng)量的80%。一般栽培3～4年即可收獲，采收一般在冬至前后，挖取根塊，除去泥土，洗凈，切片鮮用或曬干。藤條可回收用作育苗插穗。

三葉青塊根高產(chǎn)的關(guān)鍵：一是在做好田間管理的同時(shí)，控制好光照度和掌握好采收時(shí)間；二是合理施用肥料，調(diào)節(jié)土壤濕度。

3 小結(jié)

目前，對(duì)三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究主要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子水平等方面開(kāi)展，結(jié)果均顯示，三葉青遺傳資源豐富，但這些研究結(jié)果之間缺乏有機(jī)的統(tǒng)一，對(duì)三葉青種質(zhì)的品質(zhì)評(píng)價(jià)一般根據(jù)塊根產(chǎn)量和總黃酮的含量來(lái)確定，缺乏對(duì)其功能性指標(biāo)成分或分子指紋等方面的準(zhǔn)確鑒定。因此，亟待構(gòu)建一個(gè)完善、系統(tǒng)的三葉青種質(zhì)鑒定、質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。繁殖栽培方面，不論是扦插繁殖還是組培繁殖都能滿足三葉青一直以野生資源入藥的現(xiàn)狀，仿野生栽培技術(shù)的研究能很好地保持野生三葉青優(yōu)良的遺傳性狀。三葉青保護(hù)繁育工作意義重大，這不僅實(shí)現(xiàn)了珍貴中草藥三葉青的可持續(xù)發(fā)展，滿足人們對(duì)三葉青醫(yī)藥的需求，為三葉青產(chǎn)品的進(jìn)一步研究和推廣建立基礎(chǔ)，也讓這一具有地方特色的藥用植物走出國(guó)門(mén)，更好地為人類健康醫(yī)學(xué)服務(wù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 華金渭，朱波，吉慶勇，等.不同種源三葉青生物學(xué)特性與扦插育苗試驗(yàn)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56(8)：1185-1188.

[2] 李瑛琦，陸文超，于治國(guó).三葉青的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2003,34(11)：982-983.

[3] 魏克民，丁剛強(qiáng)，浦錦寶，等.中草藥三葉青抗腫瘤作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)研究雜，2007，36(11)：41-43.

[4] 蹇京蓉.中藥三葉青資源狀況及其對(duì)策研究[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2012(2)：228-230.

[5] 朱波，華金渭，劉昆，等.珍稀藥材三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,27(5)：914-919.

[6] 符淵淼.藥用植物三葉青的種質(zhì)鑒定和組培快繁研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

[7] 黃真，胡瑛瑛，王慶秋，等.浙江三葉青和廣西三葉青的生藥學(xué)鑒別[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,31(6)：759-760.

[8] 鄭軍獻(xiàn)，胡軼娟，梁衛(wèi)青，等.紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定三葉青中總黃酮的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2009,16(5)：386-387.

[9] 范世明，林婧，許文，等.不同產(chǎn)地三葉青中總黃酮含量的比較[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,23(3)：44-45.

[10] 楊志雄，王翰華.不同產(chǎn)地三葉青提取物解熱作用及對(duì)大白鼠下丘腦5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺含量的影響[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,30(3)：393-395.

[11] 付金娥，韋樹(shù)根，谷筱玉，等.三葉青藥材中微量元素的分析[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2012,29(6)：3395-3398.

[12] 浦錦寶，鄭軍獻(xiàn)，梁衛(wèi)青.一種三葉青的人工栽培方法：CNl02119625A[P].2011-07-13.

[13] 吉慶勇，程文亮，吳華芬，等.三葉青生物學(xué)特性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(1)：219-221.

[14] 鐘毓倩.三葉青的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2007,42(6)：363-364.

[15] 錢(qián)麗華.三葉青的離體快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2008,44(1)：121-123.

[16] 彭昕，林言娜，何軍邀，等.正交法優(yōu)化三葉青繼代增殖與生根培養(yǎng)的條件[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2012，26 (2)：10-12，33.

[17] 邵駿驊，邵衛(wèi)平，劉永立.三葉青高效快繁技術(shù)體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015,43(35)：208-209.

[18] 吳浩，彭昕，林言娜，等.三葉青愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基篩選[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011(21)：12l-125.

[19] 毛麗花.道地中藥材三葉青果藥套種技術(shù)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015(18)：109-110.