迷迭香酸衍生物RAD-9通過PI3K/Akt和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)胃癌MGC-803細胞凋亡

韋立群，李 清，甘嘉亮，李婉婷，潘曉杭，蔣偉哲，唐雙意

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部、3. 第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，廣西 南寧 530021)

胃癌是最為常見的癌癥死亡原因之一，2017年美國估計新增胃癌病例約28 000例，新死亡病例約有10 960例[1]。胃癌發(fā)病率和死亡率極高，對公眾的健康有重大影響，預(yù)計胃癌相關(guān)的死亡率將持續(xù)增加[2]?；熓且环N全身性治療手段，對惡性腫瘤的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用，但是化療藥物的選擇性差，在產(chǎn)生治療效果的同時，常出現(xiàn)不同程度的毒副作用[3]。因此，尋找具有低毒、高效的抗腫瘤藥物成為廣大科研人員的重要任務(wù)。面對現(xiàn)有化療藥物的特異性不足、療效不強、毒副作用較大的缺點，中藥給惡性腫瘤的臨床治療帶來新的希望。利用現(xiàn)代生化方法深入研究中藥的抗腫瘤作用機制，對發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物是很有意義的。迷迭香酸是一種天然來源的多酚羥基化合物，是迷迭香、紫蘇、夏枯草、滇丹參等中藥的有效成分，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥品等領(lǐng)域，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[4]。郭峰等[5]報道，迷迭香酸能拮抗H2O2誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡。還有研究報道，迷迭香酸可體外抑制人胃癌細胞MKN45的Warburg效應(yīng)和生長[6]。為了優(yōu)化迷迭香酸的抗腫瘤活性，本課題組前期合成了幾種迷迭香酸衍生物，通過初篩發(fā)現(xiàn)迷迭香酸衍生物RAD-9具有明顯的抗腫瘤活性，本研究進一步從細胞水平初步探討其誘導(dǎo)MGC-803細胞凋亡可能機制，為后續(xù)開發(fā)利用奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1細胞與試劑人胃癌MGC-803細胞由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科肖強課題組贈予；RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；噻唑藍(MTT) 購于中國索萊寶生物科技有限公司；熒光染料Hoechst 33258購于中國萬類生物科技有限公司；Akt、p-Akt、p38、p-p38、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人單克隆抗體，購自美國 Cell Signaling Technology 公司；0.25%胰蛋白酶、RIPA裂解液(強)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器Series 8000 WJ 型 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司)，DMILLED DFC425C型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，VersaMAXTM型多功能酶標儀 (美國 Molecular Dvices 公司)，電泳儀及半干轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及藥品儲存液的配制人胃癌細胞MGC-803用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。迷迭香酸衍生物RAD-9(純度大于90%)由本課題組合成，RAD-9溶于DMSO配制成100 mmol·L-1儲存液，避光-20℃保存，實驗時用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(DMSO終體積分數(shù)不超過0.1%)。

2.2MTT法檢測細胞增殖將對數(shù)生長期的MGC-803細胞，以4 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基配制好的終濃度為0、12.5、25、50、100、150 μmol·L-1的RAD-9藥液，每孔200 μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h。終止培養(yǎng)后，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT，于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，棄掉孔里的液體，加入100 μL DMSO，于震蕩器上避光震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，在492 nm處用酶標儀測定各孔的吸光值(A值)。細胞存活抑制率=(正常對照組A492 nm-給藥組A492 nm)/正常對照組A492 nm×100%。

2.3流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率將對數(shù)生長期的MGC-803細胞接種于6孔板中，待細胞長至80%匯合時，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞上清液，用冰PBS洗3遍(收集PBS洗液)，用不含EDTA的胰蛋白酶將細胞消化下來，收集所有細胞，用冰PBS洗3遍，棄掉PBS，加入100 μL Binding Buffer重懸細胞，再加入5 μL PI和5 μL Annexin V，避光室溫孵育15 min，再加入400 μL Binding Buffer，于1 h內(nèi)上機檢測。

2.4Hoechst33258染色法觀察細胞核的凋亡形態(tài)將對數(shù)期的MGC-803細胞接種到內(nèi)嵌有經(jīng)過無菌處理的蓋玻片的6孔板中，待細胞長至80%匯合時，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基配好的含有不同濃度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的藥液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，吸出孔內(nèi)液體，用PBS輕輕漂洗3遍，加入4%多聚甲醛固定20 min，吸出4%多聚甲醛后，用PBS輕輕漂洗3遍，再用Hoechst 33258工作液室溫避光染色20 min，吸出工作液，用 PBS輕輕漂洗3遍，再用抗熒光淬滅封片液(甘油 ∶PBS=1 ∶9)封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達將對數(shù)期的MGC-803細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞長至80%匯合時，吸出培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基配好的含有不同濃度RAD-9(0、12.5、25、50 μmol·L-1)的藥液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，吸出并收集瓶內(nèi)液體，用PBS輕輕漂洗3遍，再加入細胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心30 min，用BCA法檢測蛋白濃度。加入適量上樣蛋白緩存液，于沸水浴中高溫變性8 min，取50 μg的蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，使蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉 40 min，再將PVDF膜置于配好的一抗中冰上孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，用TBST室溫避光洗膜3遍，最后利用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并采集圖像。每組實驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1RAD-9對胃癌MGC-803細胞增殖的影響如Tab 1所示，與空白組比較，RAD-9干預(yù)胃癌MGC-803細胞24、48、72 h后，MGC-803細胞的存活率明顯受到抑制(P<0.01)。抑制效果呈時間、濃度依賴，細胞的存活率隨著藥物濃度的升高而降低，說明RAD-9可以有效抑制胃癌MGC-803細胞的增殖。

Tab 1 Effect of different concentrations of RAD-9on viability of MGC-803 cells (±s，n=3)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

3.2RAD-9對胃癌MGC-803細胞凋亡的影響如Fig 1所示，與空白組比較，12.5、25、50 μmol·L-1的RAD-9干預(yù)胃癌MGC-803細胞36 h后，MGC-803細胞出現(xiàn)明顯凋亡(P<0.01)，活細胞數(shù)隨著藥物濃度的升高而下降，晚期凋亡細胞隨著藥物濃度升高而增多，說明RAD-9可以促進胃癌MGC-803細胞的凋亡。

Fig 1 Effect of different concentrations of RAD-9 on apoptosis

A: Control group; B: 12.5 μmol·L-1RAD-9; C: 25 μmol·L-1RAD-9; D:50 μmol·L-1RAD-9; E: Bar graph of apoptosis rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

3.3RAD-9對胃癌MGC-803細胞核凋亡形態(tài)學(xué)的影響Fig 2的Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，與空白組比較，12.5、25、50 μmol·L-1的RAD-9干預(yù)胃癌MGC-803細胞36 h后，空白組中的細胞核形態(tài)呈圓形，淡藍色；而經(jīng)RAD-9處理后的細胞，細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，可見凋亡的細胞由于細胞核固縮，細胞核染色質(zhì)凝聚、固縮呈明亮的月牙狀、不規(guī)則圓形、橢圓形亮藍白色亮光。表明 RAD-9對MGC-803細胞有一定的促凋亡作用。

Fig 2 Effect of RAD-9 on morphology of MGC-803 cells(×200)

A:Control group; B:12.5 μmol·L-1RAD-9; C: 25 μmol·L-1RAD-9; D:50 μmol·L-1RAD-9

3.4RAD-9對人胃癌MGC-803細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 3所示，與空白組相比，RAD-9作用36 h后，給藥組Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax、caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)，提示RAD-9對促凋亡蛋白具有明顯的誘導(dǎo)作用。

Fig 3 Effect of RAD-9 on expression of apoptosis-relatedproteins in MGC-803 cells (±s, n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

3.5RAD-9對人胃癌MGC-803細胞Akt、p38信號通路蛋白的影響如Fig 4所示，與空白組相比，RAD-9作用36 h后，Akt、p-Akt蛋白表達下調(diào)(P<0.01)，p38 MAPK通路蛋白p38、p-p38上調(diào)(P<0.01)。提示RAD-9可能是通過抑制PI3K/Akt、激活p38 MAPK信號通路，誘導(dǎo)胃癌MGC-803凋亡。

Fig 4 Effect of RAD-9 on expression of Akt, p-Akt, p38, p-p38proteins in MGC-803 cells(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

4 討論

最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年中國有67.9萬例新發(fā)胃癌患者，有49.8萬人死于胃癌[7]。可見，胃癌仍然是臨床上威脅國人健康最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。盡管有外科手術(shù)和化療等有效的治療手段，但我國胃癌總體預(yù)后仍不太樂觀[8]。中藥在胃癌等腫瘤治療中具有一定優(yōu)勢[9]，因此，如何挖掘和開發(fā)更多療效好、毒性低的抗腫瘤中藥，對改善胃癌預(yù)后具有很重要的現(xiàn)實意義。

細胞凋亡是組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，受通路激活和抑制相互作用的調(diào)控，細胞凋亡的調(diào)控異常與神經(jīng)退行性疾病、慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病等明顯相關(guān)[10]，這種主動誘導(dǎo)細胞死亡是中藥抗腫瘤治療的重要機制之一[9]。本研究結(jié)果顯示，RAD-9能明顯抑制人胃癌MGC-803 細胞的增殖，并隨著濃度的遞增，出現(xiàn)更多核固縮等凋亡形態(tài)學(xué)特征的腫瘤細胞，流式細胞術(shù)定量檢測結(jié)果也顯示，凋亡細胞數(shù)隨著藥物濃度增大而增多。進一步的Western blot檢測結(jié)果顯示，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達明顯減少，而促進凋亡的Bax蛋白水平明顯提高，凋亡啟動標志蛋白caspase-3表達明顯增強。這些結(jié)果提示RAD-9具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。

PI3K/Akt信號通路是細胞的重要調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)細胞生長、代謝、凋亡、轉(zhuǎn)移、化療耐藥等，在大多數(shù)人類腫瘤中存在表達失調(diào)，越來越多的研究表明，PI3K/Akt與許多類型癌癥(包括胃癌)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。PI3K/Akt可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族成員，Akt的激活能使Bcl-2從聚合體中釋放出來，從而發(fā)揮抗凋亡作用[12]，因此，抑制PI3K/Akt通路可以抑制腫瘤的生長或發(fā)展。在本研究中，迷迭香酸衍生物RAD-9可以明顯抑制Akt、p-Akt蛋白表達水平，提示RAD-9可以明顯抑制PI3K/Akt通路的信號傳導(dǎo)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)包括 JNK、p38和ERK，其中p38受紫外線、滲透壓、熱休克和多種細胞因子等刺激而產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移、侵襲和死亡等，其功能異常與腫瘤的發(fā)生、進展和患者的生存期明顯相關(guān)[13]。活化的p38可誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)caspases家族蛋白的活化[14]。p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要與促進腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)，p-p38對腫瘤的形成有負向調(diào)控作用，能抑制惡性腫瘤的形成和腫瘤細胞的增殖。p38 MAPK促進細胞凋亡的機制主要有：增強c-myc基因表達，促進p53、c-jun磷酸化，參與介導(dǎo)Fas/FasL凋亡途徑，使Bax轉(zhuǎn)位以誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑等，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。我們的研究顯示，RAD-9干預(yù)MGC-803細胞后，p38、p-p38明顯上調(diào)，提示RAD-9可能通過激活p38 MAPK通路，誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，迷迭香酸衍生物RAD-9可以抑制胃癌MGC-803細胞增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與抑制PI3K/Akt、激活p38 MAPK信號通路有關(guān)，本研究為開發(fā)和改造迷迭香酸衍生物提供了理論參考。

(致謝：本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心完成，感謝實驗室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)

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