抗氧化肽AOP1對(duì)小鼠皮膚燙傷創(chuàng)面愈合修復(fù)的影響

秦 迪，張慧杰，楊希營，陳艷通，林維平，李文輝，孫同毅，高媛媛

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1. 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東省高校生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 麻醉學(xué)系， 3. 藥學(xué)院，山東 濰坊 261053)

皮膚燙傷是日常生活中常見的一種皮膚損傷形式。實(shí)驗(yàn)研究表明，皮膚燙傷后，常伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會(huì)導(dǎo)致燙傷創(chuàng)面再損傷，形成水腫、炎癥反應(yīng)和遠(yuǎn)離的器官的損傷，甚至產(chǎn)生休克[1-2]。此外，過度氧化應(yīng)激反應(yīng)與炎癥反應(yīng)會(huì)相互促進(jìn)，進(jìn)而使傷口修復(fù)發(fā)生惡性循環(huán)[3]，導(dǎo)致傷口創(chuàng)面產(chǎn)生壞死[1]，不利于創(chuàng)面愈合。

研究表明，兩棲動(dòng)物皮膚分泌物中的活性肽具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物功能。王利鋒等[4]已證實(shí)，大鯢皮膚分泌液中的抗菌肽對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)面感染具有較好的保護(hù)作用。目前已知發(fā)揮生物功能的分子主要是蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、蟾毒色胺類、甾醇類、吲哚總生物堿等化學(xué)成分[5-7]，而對(duì)皮膚分泌物中蛋白和肽類的研究較少[8]。Liu等[9]研究表明，來源于無指盤臭蛙皮膚分泌物中的AH90具有加速傷口愈合的作用。來源于云南臭蛙(Odorranaandersonii)的AOP1，由9個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為1 063.28 u。研究證明，AOP1對(duì)2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]和2,2-聯(lián)苯基-1-1苦基肼基[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl, DPPH]具有較好的清除能力，對(duì)因紫外產(chǎn)生的皮膚損傷具有良好的保護(hù)功能[10]。通常，皮膚燙傷會(huì)導(dǎo)致皮膚表皮細(xì)胞及真皮層成纖維細(xì)胞的損傷，在組織修復(fù)階段，表皮細(xì)胞參與表皮重建，其增殖與遷移有利于創(chuàng)面修復(fù)，而成纖維細(xì)胞具有恢復(fù)皮膚正常形態(tài)與功能的作用[11]。為進(jìn)一步研究該小分子活性多肽的功能，本實(shí)驗(yàn)通過驗(yàn)證抗氧化肽AOP1對(duì)自由基和細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力，采用小鼠皮膚燙傷模型，以創(chuàng)面愈合率、皮膚組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性等為指標(biāo)，初步探討天然抗氧化肽AOP1對(duì)皮膚燙傷創(chuàng)面愈合的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年昆明♀小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007。

1.2細(xì)胞與試劑人永生化表皮細(xì)胞HaCaT和小鼠皮膚成纖維細(xì)胞L929購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。抗氧化肽AOP1(純度：95%)由吉爾生化上海有限公司提供；過硫酸鉀、ABTS、DPPH均購自美國Sigma公司；MEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT和胰蛋白酶購自索萊寶科技有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒、MDA測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器SpectraMax M5型多功能熒光酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；BX53型熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS)；AR224CN型電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；Sorvall LYNX型高速離心機(jī)(Thermo)；HHS型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.4方法

1.4.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定方法在Zhou等[12]方法上稍作修改，將抗氧化肽AOP1用無菌水配成5、10、20、30、40、50 μmol·L-15個(gè)濃度梯度。取上述各樣品液200 μL于潔凈試管中，每管各加入3.8 mL濃度為5×10-5mol·L-1的DPPH溶液，混勻后，在室溫下避光反應(yīng)30 min。517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各管吸光值。清除率按照下列公式計(jì)算：清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。式中A0表示DPPH溶液的吸光值；Ai為加入樣品后溶液的吸光值；Aj為樣品溶液的吸光值。

1.4.2ABTS+·自由基清除能力的測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)[13]的方法并略作修改，將濃度為2.8 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液加入到7 mmol·L-1的ABTS+儲(chǔ)備液后，于37℃避光條件下溫育6 h以上。各取800 μL濃度為5、10、20、30、40、50 μmol·L-1的樣品液于5個(gè)潔凈試管中，分別加入3.2 mL用無菌水稀釋50倍后的ABTS+·工作液，混合均勻，光下反應(yīng)10 min 。用無菌水調(diào)零，在415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品的吸光值。清除率按照下列公式計(jì)算：清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。式中A0表示ABTS工作溶液的吸光值；Ai為加入樣品后溶液的吸光值；Aj為樣品溶液的吸光值。

1.4.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HaCaT和L929細(xì)胞，按8×107·L-1的細(xì)胞量接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL含藥無血清培養(yǎng)基(AOP1濃度梯度為5、10、20、50、100 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 。結(jié)束后，每孔加入10 μL濃度為5 g·L-1的MTT溶液反應(yīng)4 h，棄上清，并加入DMSO溶液150 μL，37℃恒溫震蕩15 min后，于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔A490值，并計(jì)算細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.4.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將HaCaT細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，細(xì)胞融合后，通過劃痕模擬傷口，并用D-Hank’s緩沖液清洗3遍。加入2 mL濃度為100 mg·L-1抗氧化肽AOP1培養(yǎng)觀察。用顯微鏡從0 h開始，每隔6 h觀察直至培養(yǎng)48 h。細(xì)胞的覆蓋面積用Jmicro Vision軟件分析。模擬傷口愈合率按照下列公式計(jì)算：傷口愈合率=(初始劃痕面積-各時(shí)間點(diǎn)劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.4.5細(xì)胞ROS的測(cè)定 選擇生長(zhǎng)狀況良好的HaCaT和L929細(xì)胞，稀釋成8×107·L-1的單細(xì)胞混懸液，接種于48孔板中，培養(yǎng)18～24 h。實(shí)驗(yàn)組每孔加入200 μL抗氧化肽AOP1稀釋液(濃度為5、10、20、50、100 mg·L-1)，正?？缀蛯?duì)照孔加入等量無血清培養(yǎng)液(每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)23.5 h。正常孔加入200 μL無血清培養(yǎng)基，對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔加入H2O2稀釋液(濃度500 μmol·L-1)誘導(dǎo)30 min，裝載濃度為4 μmol·L-1的DCFH-DA探針20 min。PBS清洗3遍，收集細(xì)胞并于488 nm激發(fā)光、525 nm發(fā)射光條件下，用多功能熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。

1.4.6小鼠皮膚燙傷模型的制備 將小鼠正常飼養(yǎng)7 d后，涂抹質(zhì)量濃度為10 g·L-1的Na2S進(jìn)行小鼠背部脫毛處理，37℃溫水擦洗干凈。24 h后，小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為35 g·L-1的水合氯醛(10 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉。將自制帶手柄、直徑為1 cm的銅圓柱體放于80℃水中2 min，取出后立即緊貼小鼠背部去毛皮膚區(qū)域持續(xù)10 s。皮膚燙傷30 min后，隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組和AOP1組，分籠飼養(yǎng)18 d。動(dòng)物模型建立后前9 d，每天皮膚涂藥1次(藥物濃度100 mg·L-1)；后9 d不作處理。

1.4.7皮膚燙傷創(chuàng)面愈合觀察 通過觀察皮膚燙傷創(chuàng)面的愈合情況，確定燙傷愈合所需時(shí)間。燙傷面積的計(jì)算以小鼠燙傷模型建立12 h后形成的面積為基準(zhǔn)，在燙傷后12 h及3、6、9、12、15、18 d不同采樣點(diǎn)，每組各取3只小鼠，數(shù)碼相機(jī)采集每只小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面，利用Image J圖像處理與分析軟件，分析每只小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率=(初始燙傷面積-各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積)/初始燙傷面積×100%。

1.4.8組織病理學(xué)切片與觀察 分別在小鼠燙傷后12 h及3、6、9、12、15、18 d不同采樣點(diǎn)，取包含燙傷創(chuàng)面組織周圍直徑5 mm的組織，置于4%的多聚甲醛中固定。將固定好的組織脫水、包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.9小鼠皮膚創(chuàng)面組織中MDA含量和SOD活性的測(cè)定 分別在小鼠燙傷后12 h及3、6、9、12、15、18 d不同采樣點(diǎn)，每組各取3只小鼠，迅速采集創(chuàng)面組織，于冰浴條件下組織勻漿，在4℃條件下4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得組織勻漿液。然后分別按照SOD試劑盒和MDA測(cè)定試劑盒的操作使用說明，分別于450 nm和532 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各樣品的吸光值，并分析SOD活性及MDA的含量。

2 結(jié)果

2.1AOP1對(duì)自由基的清除作用如Fig 1所示，來源于云南臭蛙皮膚中的具有天然活性的抗氧化肽AOP1對(duì)DPPH具有清除作用，當(dāng)AOP1濃度為50 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)DPPH的清除率為29.56%；AOP1對(duì)ABTS+· 同樣具有清除作用，且對(duì)ABTS+·的清除率與AOP1濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，當(dāng)AOP1濃度為50 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)ABTS+·自由基的清除率達(dá)到26.38%。說明抗氧化肽AOP1對(duì)自由基具有較好的清除作用。

Fig 1 The free radical scavenging rate ofantioxidant peptide AOP1(±s, n=3)

A: The clearance rate of AOP1to ABTS free radicals; B: The clearance rate of AOP1to DPPH free radicals.

2.2AOP1對(duì)正常細(xì)胞活性的影響選用HaCaT和L929細(xì)胞檢測(cè)抗氧化肽AOP1的毒性，如Fig 2所示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的抗氧化肽AOP1作用于HaCaT和L929細(xì)胞24 h后，當(dāng)AOP1濃度大于5 mg·L-1時(shí)，L929細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞存活率均為100%以上。說明在一定濃度范圍內(nèi)，抗氧化肽AOP1對(duì)HaCaT和L929細(xì)胞無毒副作用，且能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高正常細(xì)胞的活性。

Fig 2 Effect of antioxidant peptideAOP1 on normal cell viability (±s, n=5)

A: Effect of antioxidant peptide AOP1on survival rate of HaCaT cells; B: Effect of antioxidant peptide AOP1on survival rate of L929 cells.

2.3AOP1對(duì)體外細(xì)胞遷移與增殖的影響表皮細(xì)胞在炎癥階段和傷口愈合階段參與表皮的重建，用HaCaT細(xì)胞探究AOP1對(duì)正常皮膚細(xì)胞增殖和遷移的影響。如Fig 3所示，與空白對(duì)照組對(duì)比，AOP1具有明顯促使HaCaT細(xì)胞遷移與增殖的作用，并且在48 h內(nèi)能明顯促進(jìn)傷口愈合(P<0.01)。說明AOP1能促使細(xì)胞的遷移與增殖，明顯改善燙傷創(chuàng)面的愈合情況，提高傷口愈合速率。

2.4AOP1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用HaCaT和L929細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)30 min后，如Fig 4所示，當(dāng)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS升高25.08%時(shí)，L929細(xì)胞升高36.90%。與對(duì)照組相比，不同濃度的AOP1均能降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)H2O2誘導(dǎo)的ROS(P<0.05或P<0.01)；隨著AOP1濃度的增加，L929細(xì)胞內(nèi)ROS的含量呈下降趨勢(shì)，其中，AOP1濃度為100 mg·L-1時(shí)，能明顯降低L929細(xì)胞中ROS的含量(P<0.05)。說明AOP1對(duì)HaCaT和L929細(xì)胞內(nèi)的ROS具有較好的清除作用，能夠保護(hù)皮膚細(xì)胞免受過量ROS的損傷。

Fig 3 The healing rate of HaCaT cellsin different time points (±s, n=3)

**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of antioxidant peptide

A: Effect of AOP1on H2O2-induced ROS of HaCaT cells; B: Effect of AOP1on H2O2-induced ROS of L929 cells.*P<0.05,**P<0.01vsH2O2control group.

2.5小鼠創(chuàng)面愈合觀察形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，如Fig 5A所示，小鼠皮膚燙傷12 h后，兩組無明顯差異。9 d后，對(duì)照組小鼠皮膚炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，組織出現(xiàn)壞死，組織液滲出較多；與對(duì)照組相比，AOP1組無壞死、炎癥反應(yīng)，沒有組織液滲出，并已結(jié)痂，新生皮膚形成。燙傷形成15 d后， AOP1組小鼠燙傷創(chuàng)面基本完成結(jié)痂，并形成紅潤且富有彈性的復(fù)生皮膚組織；而對(duì)照組小鼠復(fù)生皮膚組織剛剛形成。提示AOP1能夠抑制組織壞死和炎癥反應(yīng)，加速傷口愈合。傷口的愈合狀況常用傷口愈合率作為重要指標(biāo)。如Fig 5B所示，6 d后，與對(duì)照組比較，AOP1組小鼠皮膚傷口愈合率明顯提高(P<0.01)。說明抗氧化肽AOP1能夠有效縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口結(jié)痂和新生組織的生長(zhǎng)，有利于傷口愈合。

2.6小鼠皮膚創(chuàng)面組織學(xué)觀察皮膚燙傷后3 d，如Fig 6A所示，對(duì)照組皮膚結(jié)構(gòu)紊亂，表皮脫落，炎性細(xì)胞大量富集；而AOP1組創(chuàng)面各級(jí)組織結(jié)構(gòu)較為完整，組織基本無水腫現(xiàn)象。15 d后，AOP1組小鼠皮膚創(chuàng)面基本愈合，復(fù)生表皮及真皮層，排列規(guī)則有序；而對(duì)照組小鼠皮膚構(gòu)造紊亂，炎性細(xì)胞浸潤明顯。與對(duì)照組相比，AOP1組新生上皮組織增厚，各組織層結(jié)構(gòu)界限清晰完整，組織排列有序，血管復(fù)原良好，且無充血現(xiàn)象。說明AOP1可減輕炎性反應(yīng)，促進(jìn)新生組織的形成和皮膚結(jié)構(gòu)的有序排列，加速傷口愈合。Masson染色結(jié)果如Fig 6B顯示，AOP1組小鼠在燙傷6 d后，大量膠原纖維(藍(lán)色)在組織結(jié)構(gòu)中生成；而對(duì)照組皮膚組織中僅有少量膠原纖維存在。小鼠皮膚燙傷18 d，AOP1組形成較厚的上皮組織，皮膚附屬器較多，膠原纖維排列規(guī)則、有序，趨向于正常皮膚；而對(duì)照組新生上皮組織較薄，并富集有大量粗膠原纖維，排列雜亂無序。說明AOP1能夠促進(jìn)膠原纖維的形成及有序排列，進(jìn)而促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合。

2.7AOP1對(duì)小鼠皮膚組織中MDA含量和SOD活性的影響采用TBA法檢測(cè)小鼠創(chuàng)傷皮膚中MDA含量。如Fig 7所示，在相同時(shí)間點(diǎn)中，與對(duì)照組相比，AOP1組的小鼠皮膚中MDA含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。隨著創(chuàng)面?zhèn)诘挠希m然AOP1組和對(duì)照組小鼠皮膚組織中SOD活性無明顯差異(P>0.05)，但兩組小鼠皮膚中SOD活性均逐漸增強(qiáng)。說明AOP1可降低皮膚創(chuàng)面愈合過程中MDA含量，從而對(duì)皮膚燙傷愈合起保護(hù)作用。

A: Morphological observation of skin healing in back of mice; B: Changes in healing rate of wounds.**P<0.01vscontrol group.

3 討論

皮膚燙傷會(huì)造成皮膚組織細(xì)胞氧化應(yīng)激而產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而使創(chuàng)面組織發(fā)生水腫和炎癥反應(yīng)，延緩創(chuàng)面愈合的進(jìn)程[2-3]。復(fù)雜有序的皮膚創(chuàng)面愈合，包含著傷口發(fā)生炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與遷移形成皮膚肉芽組織和重塑基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)等不同的過程[14]。前期研究表明，來源于云南臭蛙的AOP1具有較好的清除ABTS及DPPH自由基的能力[10]。創(chuàng)面愈合過程中，表皮細(xì)胞參與表皮重建，其增殖與遷移能夠促進(jìn)傷口愈合。在此基礎(chǔ)上，細(xì)胞遷移與增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，100 mg·L-1的AOP1在12 h內(nèi)可明顯提高模擬傷口愈合率；藥物作用48 h后，模擬傷口愈合率可提高20.42%。說明抗氧化肽AOP1可促進(jìn)傷口愈合，并證實(shí)其對(duì)HaCaT 和L929細(xì)胞均無細(xì)胞毒性。

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皮膚燙傷后，傷口表面常伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[1]。本研究中，利用H2O2模擬皮膚燙傷后組織細(xì)胞產(chǎn)生ROS，結(jié)果顯示，不同細(xì)胞內(nèi)ROS的量與藥物濃度均呈現(xiàn)一定的聯(lián)系；當(dāng)AOP1濃度為100 mg·L-1時(shí)，對(duì)HaCaT和L929細(xì)胞內(nèi)ROS的清除率分別為41.24%和21.86%。提示AOP1對(duì)HaCaT和L929細(xì)胞內(nèi)的ROS具有較好的清除作用，能夠保護(hù)皮膚細(xì)胞免受ROS損傷。

本實(shí)驗(yàn)中，抗氧化肽AOP1用純水溶解，為消除其性狀、溶解方式和給藥途徑的影響，選用純水為對(duì)照組。結(jié)果顯示，連續(xù)涂抹9 d抗氧化肽AOP1可明顯促進(jìn)小鼠燙傷創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合所需時(shí)間，提高創(chuàng)面愈合率；在創(chuàng)面形成后15 d，AOP1組小鼠皮膚傷口愈合率可達(dá)94.45%。新生組織色澤與原皮膚基本一致，且富有彈性。

機(jī)體對(duì)自由基的清除能力常用SOD的活性反映，而MDA常被作為脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中，MDA含量和SOD活性的聯(lián)合檢測(cè)常用來評(píng)估機(jī)體的抗氧化能力和受損水平[15]。本研究中，兩組小鼠皮膚中SOD活性均呈升高趨勢(shì)，但AOP1組與對(duì)照組相比，燙傷創(chuàng)面組織中MDA含量明顯下降。提示抗氧化肽AOP1可抑制氧自由基對(duì)創(chuàng)面的損傷，提高機(jī)體清除自由基的能力，有益于小鼠燙傷皮膚愈合。

Fig 6 Morphological observation of mouse skin tissues

Fig 7 Comparison of MDA content in wound tissue ofmice at different time points (±s, n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

綜上所述，本研究從細(xì)胞和動(dòng)物水平證實(shí)了抗氧化肽AOP1可對(duì)小鼠皮膚燙傷的傷口愈合修復(fù)起到促進(jìn)作用，能夠縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間；其途徑主要是通過降低ROS的含量，進(jìn)而防止創(chuàng)面組織中脂質(zhì)過氧化的程度。關(guān)于抗氧化肽AOP1對(duì)皮膚燙傷修復(fù)進(jìn)程中涉及的有關(guān)分子機(jī)制和信號(hào)通路，尚需進(jìn)一步研究。

(致謝：本研究所有實(shí)驗(yàn)均在濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院山東省高校生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝本課題組所有老師的指導(dǎo)和同學(xué)的幫助。)

[1] Parihar A, Parihar M S, Milner S, et al. Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury[J].Burns, 2008,34(1):6-17.

[2] Deng J, Wang G, Huang Q, et al. Oxidative stress-induced leaky sarcoplasmic reticulum underlying acute heart failure in severe burn trauma[J].FreeRadicBiolMed, 2008,44(3):375-85.

[3] Biesalski H K, Mcgregor G P. Antioxidant therapy in critical care-is the microcirculation the primary target[J]?CritCareMed, 2007,35(9 Suppl):577-83.

[4] 王利鋒, 李學(xué)英, 王大忠. 大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對(duì)銅綠假單胞菌感染小鼠創(chuàng)面的抗菌作用[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2011,26(4):336-9.

[4] Wang L F, Li X Y, Wang D Z. Antibacterial effect of antimicrobial peptide from skin secretions of Audrias davidiauus on the wound of Pseudomouas aerugiuosa infection in mice[J].WestChinaJPharmSci, 2011,26(4):336-9.

[5] Wang D L, Qi F H, Tang W, et al. Chemical constituents and bioactivities of the skin of Bufo bufo gargarizans Cantor[J].ChemBiodivers, 2011,8(4):559-67.

[6] Li X, Guo Z, Wang C, et al. Purification of bufadienolides from the skin of Bufo bufo gargarizans, Cantor with positively charged C18 column[J].JPharmBiomedAnal, 2014,92:105-13.

[7] 馬麗娜, 宋 兵, 金 花,等. 華蟾素對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的殺傷作用研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2011,27(1):37-41.

[7] Ma L N, Song B, Jin H, et al. Research of the killing effects of cinobufacini on MCF-7 cells[J].ChinPharmacolBull, 2011,27(1):37-41.

[8] 展 波, 高媛媛, 林維平,等. 中華大蟾蜍皮膚Cathelicidin家族新型抗菌肽的鑒定及其抗菌活性[J]. 中國中藥雜志, 2016,41(4):630-5.

[8] Zhan B, Gao Y Y, Lin W P, et al. Identification and bactericidal activity of a novel Cathelicidin family member from skin of Bufu bufo gargarizans[J].ChinaJChinMaterMed, 2016,41(4):630-5.

[9] Liu H, Mu L, Tang J, et al. A potential wound healing-promoting peptide from frog skin[J].IntJBiochemCellBiol, 2014,49:32-41.

[10] Yang X, Wang Y, Zhang Y, et al. Rich diversity and potency of skin antioxidant peptides revealed a novel molecular basis for high-altitude adaptation of amphibians[J].SciRep, 2016,6:19866.

[11] Guo L, Huang X, Liang P, et al. Role of XIST/miR-29a/LIN28A pathway in denatured dermis and human skin fibroblasts (HSFs) after thermal injury[J].JCellBiochem, 2017 Aug 3. doi: 10.1002/jcb.26307. [Epub ahead of print]

[12] Zhou H C, Lin Y M, Wei S D, et al. Structural diversity and antioxidant activity of condensed tannins fractionated from mangosteen pericarp[J].FoodChem, 2011,129(4):1710-20.

[13] Cai Y, Luo Q, Sun M, et al. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].LifeSci, 2004,74(17):2157-84.

[14] Schreml S, Szeimies R M, Prantl L, et al. Wound healing in the 21st century.[J].JAmAcadDermatol, 2010,63(5):866-81.

[15] 蘇 愛, 朱紅燕, 徐宏偉,等. 海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(2):251-7.

[15] Su A, Zhu H Y, Xu H W, et al. Effect of Aplysin on ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2):251-7.