IL- 17參與巨細(xì)胞病毒肝炎致病機(jī)制的研究①

劉玲玲 黃 媛 馬 迪 廖 毅 劉興樓 李 革 舒賽男 方 峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科病毒實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030)

人類巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，是一種dsDNA病毒，具有與其他皰疹病毒類似的潛伏- 活化及持續(xù)感染的特性。但其致病力較弱，是一種機(jī)會(huì)性致病原。主要對(duì)免疫力低下(如新生兒、嬰幼兒)、免疫抑制(如器官移植患者等)和免疫缺陷(如艾滋病患者)的人群造成危害。肝臟是最易受累的器官，感染者約60%～80%出現(xiàn)肝臟損傷，表現(xiàn)為肝脾大、黃疸及肝功能受損[1- 3]。

肝臟是CMV感染的主要靶器官，不僅在全身播散性感染時(shí)容易受累，還是主要受累的單個(gè)器官之一。臨床上，巨細(xì)胞病毒性肝炎可表現(xiàn)為黃疸型或無黃疸型肝炎，常有輕～中度肝腫大伴血清肝酶輕～中度升高，常伴脾大，可伴不同程度膽汁淤積。炎性因子IL- 17，是Th17細(xì)胞主要的效應(yīng)分子，其過高表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)，其中，肝臟疾病包括自身免疫性肝病、急性肝損傷、慢性病毒性肝病及肝細(xì)胞癌等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量及其分泌IL- 17的量都顯著上調(diào)，與ALT升高顯著相關(guān)，并參與膽管的慢性炎癥過程，介導(dǎo)肝纖維化的形成[4,5]。研究顯示IL- 17在巨細(xì)胞病毒性肝炎中也發(fā)揮著重要的作用，基于此，我們將在整體水平上對(duì)促炎因子IL- 17對(duì)巨細(xì)胞病毒肝炎中的致病機(jī)制進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 4周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級(jí)[合格證號(hào)：SCXK(鄂)2008- 0005]，購于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物室潔凈層柜內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.1.2病毒 MCMV Smith株(美國德克薩斯大學(xué)健康衛(wèi)生中心惠贈(zèng))在BALB/c小鼠唾液腺中傳毒增殖，收獲病毒用于本實(shí)驗(yàn)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)測定收獲病毒的平均感染性滴度為4.9×105PFU/ml。

1.1.3MCMV感染小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 參考文獻(xiàn)[6,7]：①正常對(duì)照組：每只小鼠腹腔注射200 μl相同稀釋的正常唾液腺組織勻漿；②MCMV感染對(duì)照組：每只小鼠腹腔接種200 μl含5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿；③同型抗體阻斷對(duì)照組：每只小鼠腹腔注射200 μl含5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿，同時(shí)在感染后第3天、第5天腹腔注射同型抗體100 μg/只；④IL- 17抗體阻斷組：每只小鼠腹腔注射200 μl含 5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿，同時(shí)在感染后第3天、第5天腹腔注射100 μg/只的抗小鼠IL- 17抗體。在病毒感染后第7天收獲小鼠。

1.2方法

1.2.1用Western blot法檢測肝臟組織中IL- 17蛋白表達(dá)水平 提取肝臟組織蛋白，經(jīng)蛋白裂解液裂解后應(yīng)用BCA蛋白測定試劑盒測定裂解液上清中的蛋白濃度。各樣本取50 μg蛋白上樣，經(jīng)電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉液浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。兔抗鼠IL- 17(1∶1 000),β- actin(1∶500)稀釋，將已封閉的PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，排出氣泡，4℃孵育過夜。羊抗兔結(jié)合HRP的特異IgG二抗(1∶5 000)孵育后，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Quantity one 4.62軟件測定各蛋白光密度值，以β- actin條帶為內(nèi)參進(jìn)行蛋白上樣量的校正，以此對(duì)目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.2.2ELISA法檢測血清中IL- 17水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測試驗(yàn)過程中小鼠血清中IL- 17水平。

1.2.3用HE染色法評(píng)估肝臟組織的病理性損傷程度 石蠟包埋肝臟組織切片行蘇木紫- 伊紅染色，并對(duì)其組織損傷進(jìn)行評(píng)估。肝臟組織損傷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Knodell肝組織病變活動(dòng)性積分(Histological activity index,HAI)進(jìn)行評(píng)估[8,9]。應(yīng)用Olympus BX41顯微鏡攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，每個(gè)標(biāo)本選擇3張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(200×)進(jìn)行觀察。

1.2.4RT- PCR法檢測肝臟組織內(nèi)IL- 17R、IFN- γ和IL- 10基因轉(zhuǎn)錄(mRNA)水平 用Trizol法提取肝臟組織總的RNA，檢測RNA純度 為1.959～2.089；反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按試劑盒(Thermo提供)操作，cDNA合成模板RNA取5 μg；PCR試劑盒由Fermentas提供，每份樣本同時(shí)檢測目的基因和內(nèi)參GAPDH基因。引物序列如表1[10- 12]： PCR反應(yīng)體系：樣本 cDNA 1 μl ，上、下游引物(pmol)各1 μl，共50 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：IL- 17R與GAPDH:95℃預(yù)變性5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s，共36個(gè)循環(huán)。IFN- γ:95℃ 預(yù)變性5 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，30 s，共28個(gè)循環(huán)。IL- 10:95℃ 預(yù)變性5 min；95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析其IL- 17R、IFN- γ和IL- 10與GAPDH的Volume(CNTx mm2)比值，即用相對(duì)比值來表示IL- 17R、IFN- γ和IL- 10 mRNA的表達(dá)量。

表1引物序列

Tab.1Primersequences

GenePrimersequencesbpIL-17RSense5'-CCACTCTGTAGCACCCCAATG-3'Antisense5'-CCTGGAGATGTAGCCCTGGTC-3'225IFN-γSense5'-TTTGAGGTCAACAACCCACA-3'Antisense5'-CGCAATCACAGTCTTGGCTA-3'388IL-10Sense5'-GAAAAGAGAGCTCCATCATGCCTGG-3'Antisense5'-GATTTAGAGAGCTCTGTCTAGGTCC-3'623GAPDHSense5'-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3'Antisense5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'151

1.2.5用羅氏生化分析儀檢測血清ALT水平 血清ALT水平由 DPPI羅氏生化分析儀檢測。

2 結(jié)果

2.1腹腔注射IL- 17抗體后組織內(nèi)IL- 17表達(dá) 建立MCMV全身播散性感染模型后，通過腹腔注射IL- 17抗體中和其體內(nèi)表達(dá)的IL- 17蛋白。采用Western blot檢測其在肝臟組織中IL- 17表達(dá)情況。肝臟組織結(jié)果顯示，IL- 17抗體阻斷組IL- 17表達(dá)量與MCMV感染對(duì)照組及同型抗體對(duì)照組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，P<0.05)，表明腹腔注射IL- 17抗體有效阻斷了肝臟組織中IL- 17的表達(dá)。

圖1 IL- 17抗體阻斷效應(yīng)Fig.1 Blocked IL- 17 in vivoNote: 1.Control；2.MCMV infected mice；3.Anti- 17 mice；4.Isotype control.

圖2 各實(shí)驗(yàn)組血清IL- 17水平測定Fig.2 Levels of IL- 17 in serumNote: *.P<0.05.

2.2血清中IL- 17水平 與同型抗體對(duì)照組及MCMV感染對(duì)照組相比，IL- 17抗體阻斷組的IL- 17 明顯減低(圖2)。

2.3肝臟組織病理評(píng)估 IL- 17抗體阻斷組在MCMV感染后第7天，體內(nèi)中和IL- 17表達(dá)后，肝組織中炎性細(xì)胞浸潤明顯輕于MCMV感染組及同型抗體阻斷對(duì)照組，肝臟病理評(píng)分為(4.5±0.5)，而MCMV感染組和同型抗體阻斷組的肝組織病理評(píng)分分別為(7.3±0.8)、(7.1±0.8)。說明降低IL- 17表達(dá)可以有效減輕肝組織的炎性細(xì)胞浸潤，減輕肝損傷(圖3)。

2.4血清ALT變化 IL- 17阻斷組血清 ALT水平明顯低于MCMV感染對(duì)照組小鼠及同型抗體阻斷對(duì)照組小鼠(圖4，P<0.05)。提示阻斷體內(nèi)IL- 17水平可以減輕巨細(xì)胞病毒感染所致肝損傷，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。

2.5肝組織中IL- 17R、 IFN- γ及IL- 10mRNA的表達(dá) 在感染MCMV后阻斷體內(nèi)炎性因子IL- 17表達(dá)，見IL- 17抗體阻斷組肝組織內(nèi)IFN- γ表達(dá)量明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷對(duì)照組(圖5A、B，P<0.05)。而IL- 10在IL- 17被中和后也呈現(xiàn)表達(dá)量升高，明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A、C，P<0.05)。在巨細(xì)胞病毒感染后，而IL- 17R的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(圖5A、D，P<0.05)。但是，IL- 17抗體阻斷組與MCMV感染組及同型抗體阻斷對(duì)照組之間進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A、D，P>0.05)，結(jié)果表明在體內(nèi)中和IL- 17的表達(dá)，對(duì)IL- 17R mRNA的表達(dá)沒有影響，而可以調(diào)節(jié)IFN- γ及IL- 10 mRNA的表達(dá)。

圖3 IL- 17抗體阻斷后各組肝組織病理性損傷評(píng)估(HAI評(píng)分)Fig.3 Blocking IL- 17 in vivo,pathological changes of liver in each group of mice(HAI scoring)Note: *.P<0.01.

圖4 各實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平測定Fig.4 Levels of ATL in serumNote: *.P<0.05.

圖5 阻斷體內(nèi)IL- 17后，肝臟組織中IL- 17R、IFN- γ及IL- 10的表達(dá)情況Fig.5 Blocked IL- 17 in vivo,expression of IL- 17 and IL- 17R mRNA in liver tissuesNote: *.P<0.05.1.Control；2.MCMV infected mice；3.Anti- 17 mice；4.Isotype control.

3 討論

在人類肝臟疾病中，越來越多的證據(jù)間接顯示IL- 17參與各種肝臟疾病的致病過程，包括酒精誘導(dǎo)的肝損傷、非酒精性脂肪性肝炎、肝細(xì)胞癌和原發(fā)性膽汁性肝硬化及肝移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)和自身免疫性肝炎[13，14]，并在病毒性肝炎中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。IL- 17與受體結(jié)合后，作用于kupffer細(xì)胞、單核細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及星形細(xì)胞，促進(jìn)促炎因子及趨化因子分泌，誘導(dǎo)肝臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤[16，17]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)，在MCMV播散性感染小鼠，IL- 17表達(dá)明顯增高，且肝內(nèi)IL- 17高表達(dá)與肝臟病理損傷高峰期發(fā)生在同一時(shí)相，并呈明顯相關(guān)，提示IL- 17參與MCMV感染所致肝組織免疫病理性損傷的過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL- 17與MCMV肝損傷之間的關(guān)系，我們采用腹腔注射IL- 17抗體中和體內(nèi)IL- 17進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL- 17抗體阻斷組肝組織內(nèi)IL- 17表達(dá)明顯減少，其肝組織損傷嚴(yán)重程度亦明顯輕于MCMV感染組及同型抗體阻斷組。表明IL- 17被中和以后，緩解了MCMV感染所致肝臟組織病理性損傷。同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)顯示病毒感染后IL- 17R水平升高，但中和體內(nèi)的IL- 17后，其受體表達(dá)并未受到影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在HSV- 1感染的角膜中，MIP- 2和MIP- 1α 是促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集最主要的炎性蛋白分子，在IL- 17R缺陷小鼠，由于中斷了IL- 17信號(hào)通路，降低炎性蛋白分子的表達(dá)并減弱了其對(duì)中性粒細(xì)胞的募集功能[16,17]。在單純皰疹病毒性角膜炎(Herpes simplex keratitis，HSK)患者，角膜中大量表達(dá)IL- 17，而且在培養(yǎng)的人類角膜基質(zhì)纖維細(xì)胞(Human corneal stromal fibroblasts，HCF))中檢測到IL- 17R mRNA[18]。這些實(shí)驗(yàn)說明IL- 17及其受體在病毒感染中發(fā)揮著重要的作用，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明在阻斷IL- 17表達(dá)后對(duì)其受體的表達(dá)并未受影響。Yoshimura[16]研究顯示，在體內(nèi)阻斷IFN- γ與IL- 4表達(dá)后，體內(nèi)IL- 17表達(dá)量明顯增多，并引起實(shí)驗(yàn)性自身性免疫性葡萄膜炎(Murine experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)的進(jìn)一步惡化。Savarin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IFN- γ可在IL- 17介導(dǎo)的病毒性腦脊髓炎中發(fā)揮保護(hù)作用。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阻斷IL- 17表達(dá)后，IFN- γ的mRNA表達(dá)明顯升高，我們推斷IFN- γ可能在巨細(xì)胞病毒肝炎中同樣發(fā)揮保護(hù)作用，Zhang等[20]研究也顯示IL- 17的高表達(dá)可降低 IFN- γ 水平，與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿，說明IL- 17與IFN- γ可以相互調(diào)節(jié)。 且多項(xiàng)研究顯示，Treg細(xì)胞通過增強(qiáng)IL- 10的表達(dá)抑制Th17細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫病理性損傷，同時(shí)也能抑制Th17細(xì)胞所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[18]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中和體內(nèi)IL- 17后，肝臟組織內(nèi)IL- 10 的表達(dá)量明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷組(P<0.05)，說明IL- 17與IL- 10之間也可以相互調(diào)節(jié)，由此通過阻斷IL- 17的表達(dá)，從而增加體內(nèi)IL- 10的表達(dá)量來降低組織的病理損傷。

MCMV感染的致病機(jī)制及感染結(jié)局與T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能及調(diào)節(jié)極為相關(guān)。IL- 17作為機(jī)體重要的炎性細(xì)胞因子在巨細(xì)胞病毒肝炎中發(fā)揮重要的作用，并且可以調(diào)節(jié)IFN- γ及IL- 10的表達(dá)，其在介導(dǎo)肝臟病理性損傷的同時(shí)，對(duì)巨細(xì)胞病毒肝炎也起到了免疫調(diào)節(jié)的作用。

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