咖啡樹(shù)咖啡堿合成相關(guān)基因研究進(jìn)展

李梅 徐丹旎 李麗江 尚衛(wèi)瓊 李旸 尚宇梅

摘 要 咖啡是世界三大飲料之一，其含有的咖啡堿，適量攝入對(duì)身體有益，過(guò)多則有害。因此，培育低咖啡堿或無(wú)咖啡堿咖啡品種具有非常重要的意義。目前，已從多數(shù)植物中分離并克隆出咖啡堿合成的相關(guān)基因，并研究了其表達(dá)特點(diǎn)和相關(guān)酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討培育低咖啡堿咖啡樹(shù)的可能途徑和存在的問(wèn)題。綜述近年來(lái)咖啡樹(shù)咖啡堿合成與代謝的研究進(jìn)展，展望如何培育出生長(zhǎng)快、成本低、安全穩(wěn)定的低咖啡堿植株，從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)推廣。

關(guān)鍵詞 咖啡樹(shù) ；咖啡堿 ；基因

中圖分類號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.009

Abstract Coffee was one of the three major beverages in the world. Coffee contains caffeine， and is good to the health when taken adequately but harmful when taken too much. It is， therefore， very important to breed low caffeine or caffeine-free coffee varieties. The genes related to caffeine synthesis had been isolated and cloned from most of plants， and their expression and regulatory mechanisms underlying the activities of related enzymes had been analyzed. The problems and ways of breeding low caffeine or caffeine-free coffee varieties were discussed. The research progress of caffeine synthesis and metabolism in recent years were reviewed， based on which a prospect was made for breeding and extension of low caffeine coffee varieties with fast growth， low cost， safety and stability.

Keywords coffee tree ； caffeine ； genes

咖啡是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是世界三大飲料之一，在國(guó)際貿(mào)易、熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和人類生活中具有重要作用?？Х葹檐绮菘疲≧ubiaceae）咖啡屬（Coffea genus）植物，該屬植物共100多種，主要分為四倍體和二倍體[1]。目前，主要種植的有小粒種（Coffee arabica）、中粒種（Coffee robusta）和大粒種（Coffee liberica）[2-4]。小?？Х鹊拇蠖鄶?shù)品種中，咖啡豆中咖啡堿含量約為1.0%，中粒咖啡為1.7%，大?？Х葹?.4%[5]。其中，小粒種咖啡品質(zhì)較好，種植面積大，其產(chǎn)量占全球咖啡產(chǎn)量的73%。目前，小粒咖啡較為常見(jiàn)的品種有波邦（Bourbon）、鐵畢卡（Typica）、卡杜拉（Caturra）、卡蒂姆（Catimor）、卡杜艾（Catuai）等[2]。近年來(lái)，小粒種咖啡生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為很多地區(qū)獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的特色經(jīng)濟(jì)和支撐產(chǎn)業(yè)。國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的人接受并飲用咖啡，咖啡含有咖啡堿，適量攝入對(duì)身體有益，過(guò)多則有害。在小?？Х戎?，咖啡堿的合成部位主要在葉片和鮮果中，幼苗的葉片和子葉含有咖啡堿，而根部和成熟枝條中幾乎不含有咖啡堿[6]。

咖啡堿（Caffeine）又稱咖啡因或甲基可可堿，是一種黃嘌呤生物堿化合物，其化學(xué)名為1，3，7-三甲基黃嘌呤，化學(xué)式為C8H10N4O2[7]。植物中，咖啡堿的合成代謝途徑主要分為4步反應(yīng)，包括3次由甲基轉(zhuǎn)移酶催化進(jìn)行的甲基化反應(yīng)和1次由核糖核苷水解酶催化進(jìn)行的脫核糖反應(yīng)[8]。目前，從咖啡樹(shù)中，已克隆得到 3 個(gè)咖啡堿合成的關(guān)鍵酶基因，分別為咖啡7-黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶（7-Methylxanthosine Synthase，CaXMTT1）[9]，咖啡堿合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase，CaDXMT1）[10]和雙功能酶基因（Bifunctional Coffeee Coffeine Synthase，CCS1）[11]。但是目前對(duì)小?？Х葮?shù)不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表達(dá)量差異，以及這3個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)與咖啡堿含量關(guān)系的研究尚無(wú)報(bào)道。

1 咖啡堿的作用

咖啡堿存在于許多植物中，人類最常食用的有咖啡、茶及可可等?？Х葔A是一種中樞神經(jīng)興奮劑，適度攝入可以興奮神經(jīng)中樞，提高反應(yīng)速度、集中注意力和消除疲勞[12-14]；能夠促進(jìn)胰島素分泌和降低Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，刺激呼吸系統(tǒng)，用于治療早產(chǎn)嬰兒呼吸暫停[15-17]。攝入過(guò)量的咖啡堿，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)作用，使人體對(duì)其產(chǎn)生依賴性或成癮，引起機(jī)體功能失調(diào)，甚至引發(fā)各種疾病。研究表明，攝入高劑量的咖啡堿會(huì)影響睡眠、刺激中樞神經(jīng)、提高類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率、增高血壓以及引起孕婦嬰兒早產(chǎn)等現(xiàn)象[18-20]。由于以上這些咖啡堿的負(fù)面作用，國(guó)內(nèi)及國(guó)際市場(chǎng)上，都希望有低咖啡堿或無(wú)咖啡堿的咖啡和咖啡飲品。近年來(lái)，咖啡生產(chǎn)商都在努力的降低和去除咖啡中的咖啡堿，但去除咖啡堿的同時(shí)，又保證其它成分完好無(wú)缺是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)。市場(chǎng)上諸多去除咖啡咖啡堿的方法，不僅破壞了咖啡原有的風(fēng)味，而且成本較高，但脫咖啡堿咖啡每年的市值仍然高達(dá)20億美元。

2 咖啡堿的合成途徑

20世紀(jì)60年代至70年代初，通過(guò)放射性標(biāo)記的研究，觀察咖啡組織中的轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)，初步確定可可堿（theobromine， 3，7-二甲基黃嘌呤，Tb）是咖啡堿合成的直接前體物質(zhì)。在咖啡樹(shù)葉片中，7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine， 7mXR）的放射性能轉(zhuǎn)移到咖啡堿中。Suzuki等[21]在咖啡樹(shù)愈傷組織提取物中檢測(cè)到N-核苷水解酶和N-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，證明了合成咖啡堿的前體是7mXR。研究利用RACE技術(shù)和探針篩選法等，一系列咖啡堿合成酶基因分別被克隆出，包括咖啡7-黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶（7-Methylxanthosine Synthase， CaXMT1），可可堿合成酶基因（Coffee Theobromine Synthase，CaMXMT1）、CaMXMT2，咖啡堿合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase， CaDXMT1）和雙功能酶基因（Bifunctional Coffee Coffeine Synthase， CCS1）等[9-11]。雖然以上酶的氨基酸序列相似性達(dá)80%以上，但底物專一性的差異卻較大。2007年，法國(guó)學(xué)者克隆到中果咖啡（Coffea canephora）的N-甲基轉(zhuǎn)移酶CcXMT1和CcDXMT1基因，通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)一步純化結(jié)晶，最后通過(guò)X射線衍射等方法，分析得到三維結(jié)構(gòu)[22]。但是目前對(duì)小?？Х葮?shù)不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表達(dá)量差異，以及這3個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)與咖啡堿含量關(guān)系的研究尚無(wú)報(bào)道。

植物中，咖啡堿的合成代謝途徑主要分為4步反應(yīng)，包括：1次核糖核苷水解酶催化進(jìn)行的脫核糖反應(yīng)，3次甲基轉(zhuǎn)移酶催化進(jìn)行的甲基化反應(yīng)。具體合成途徑為：腺嘌呤→腺苷酸（AMP）→次黃嘌呤核苷酸（IMP）→黃嘌呤核苷酸（XMP）→黃嘌呤核苷（XR）→7-甲基黃嘌呤核苷（7mXR）→7-甲基黃嘌呤（7-MX）→可可堿（3，7-二甲基黃嘌呤）→咖啡堿（1，3，7-三甲基黃嘌呤，Cf）[22]。N-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-Methyltransferase，NMT）是催化三步轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的關(guān)鍵[23-24]。

咖啡堿合成途徑中以黃嘌呤核苷為底物，生成7-甲基黃嘌呤核苷，是第一步反應(yīng)。Uefuji等[9]從咖啡中克隆出編碼7mXR合成酶的cDNA序列，命名為 CaXMT1。根據(jù)McCarthy等[20]關(guān)于蛋白酶化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡中的 CaXMT1 極有可能具有雙重作用，同時(shí)催化黃嘌呤核苷進(jìn)行了7-甲基轉(zhuǎn)移以及核糖消解作用。

咖啡堿合成第二步反應(yīng)的關(guān)鍵酶為：催化7mXR反應(yīng)生成7-MX的核糖核苷水解酶。Negishi等[25]從茶葉粗酶中初步分離出茶樹(shù)的核糖核苷水解酶，該酶在水解7-甲基黃嘌呤核苷時(shí)，所產(chǎn)生的D-核糖其5′-末端未被磷酸化，證明不是核苷磷酸化酶。盡管研究已檢測(cè)到茶樹(shù)中核糖核苷水解酶的生物活性，但目前有關(guān)該酶的具體蛋白表達(dá)及功能鑒定，不管在咖啡、茶葉還是其它植物中，尚無(wú)任何報(bào)道。

咖啡堿合成途徑的最后兩步反應(yīng)，同樣由甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。在茶樹(shù)中，Kato等[26]分離得到咖啡堿合酶（Caffeine Synthase， CS）；之后應(yīng)用RACE方法，克隆出咖啡堿合成酶基因，全長(zhǎng)為1 438 bp，正式命名為茶樹(shù)咖啡堿合酶（Tea Caffeine Synthase，TCS）基因TCS1[27]，隨后研究證實(shí)，TCS1具有可可堿合成酶和咖啡堿合成酶的雙重作用?；诓铇?shù)TCS1的序列信息，在咖啡中，已克隆成功編碼咖啡堿合成酶的基因CaDXMT1和CCS1，其中CCS1的活性與TCS1很相似。

此外，茶樹(shù)中的次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（Inosine 5′-Monophosphate Dehydrogenase；IMPDH）催化IMP合成XMP[28]，其cDNA全長(zhǎng)序列被克隆，命名為TIDH。茶樹(shù)中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因（SAMs）也已被克隆，序列全長(zhǎng)1 303 bp，編碼394個(gè)氨基酸[29]。SAMS催化甲硫氨酸和ATP生成SAM，而SAM是茶樹(shù)咖啡堿合成的唯一甲基供體。

Keya等[30]利用IMPDH抑制劑三氮唑核苷（ribavirin）降低了咖啡葉片中咖啡堿和可可堿的含量。Ogita等[31]通過(guò)利用 RNA 干擾技術(shù)，抑制咖啡植株中可可堿合成酶基因 CaMXMT1的表達(dá)，從而獲得了低咖啡堿含量和低可可堿含量的轉(zhuǎn)基因咖啡樹(shù)。

Denoeud等[32]獲取了中粒種咖啡的基因組草圖，鑒別出中粒種咖啡基因組中合成超過(guò) 25 000 種蛋白質(zhì)的基因。并且研究者還找到了使咖啡樹(shù)中咖啡堿的含量高于其它植物的基因家族。研究人員發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼了甲基轉(zhuǎn)移酶，從而在基因表達(dá)的過(guò)程中，增加甲基團(tuán)，從而將一種黃嘌呤核苷分子轉(zhuǎn)化為咖啡堿。此外，咖啡植株中與咖啡堿合成途徑有關(guān)的酶，與茶樹(shù)和可可植株合成途徑中的酶并不相似，這說(shuō)明三者合成咖啡堿的途徑可能是獨(dú)自演化而成。此外，與其它植物相比，咖啡植株的基因更易生成與咖啡的香味和苦味等密切相關(guān)的類黃酮和生物堿這2種物質(zhì)。

3 培育低咖啡堿咖啡樹(shù)品種的展望

研究人員在非洲發(fā)現(xiàn)了咖啡因含量?jī)H為0.07%的咖啡樹(shù)，該咖啡樹(shù)缺少合成咖啡因所需的酶。但其生長(zhǎng)速度比普通咖啡樹(shù)品種慢30%左右。研究人員希望將它與普通咖啡樹(shù)品種雜交來(lái)提高其生長(zhǎng)速度，希望最終能培育出生長(zhǎng)快、成本低、能大量生產(chǎn)上述咖啡豆的咖啡樹(shù)。研究者利用RNA干擾技術(shù)，抑制了轉(zhuǎn)基因胚胎細(xì)胞和植株幼苗中相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低了其可可堿和咖啡堿的含量。此外，目前對(duì)于咖啡堿合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)特點(diǎn)，以及相關(guān)酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制已有相關(guān)報(bào)道，但其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制還處于未知狀態(tài)，仍需新的研究手段和方法，同時(shí)，需要對(duì)其穩(wěn)定性、安全性以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值做出評(píng)價(jià)。

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