卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX和PTEN的表達(dá)及臨床意義

吳鈴+葉健文+林舟

[摘要] 目的 研究抑癌基因WWOX及PTEN對(duì)卵巢漿液性腺癌細(xì)胞生長的影響，探討卵巢癌基因治療的新靶點(diǎn)。 方法 于2013年10月—2016年10月福州市第一醫(yī)院方便選取的60例卵巢漿液性腺癌標(biāo)本作為研究對(duì)象，另選取30例正常卵巢組織作為對(duì)照。采用免疫組化檢測抑癌基因WWOX及PTEN的陽性率表達(dá)，RT-PCR法測WWOX及PTEN的mRNA相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)果 卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的免疫組化陽性率及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于正常卵巢組織組（P<0.05）。 結(jié)論 WWOX及PTEN基因缺失可能是卵巢漿液性腺癌發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，可能會(huì)干擾卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期并抑制其生長增殖，臨床研究有待從基因分子調(diào)控等方面進(jìn)一步深入探討，為卵巢漿液性腺癌的基因治療提供一種新方法。

[關(guān)鍵詞] 漿液性腺癌；抑癌基因；WWOX；PTEN

[中圖分類號(hào)] R725 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）11（c）-0023-03

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of WWOX and PTEN on the growth of ovarian serous adenocarcinoma cells and to explore the new target of ovarian cancer gene therapy. Methods From October 2013 to October 2016， 60 cases of ovarian serous sex adenocarcinoma were selected from fuzhou first hospital，30 other normal ovarian tissue were selected as the control.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR. Results The immunohistochemical positive rate of mRNA and mRNA expression of WWOX and PTEN in ovarian serous adenocarcinoma were significantly lower than those in normal ovarian tissue （P<0.05）. Conclusion WWOX and PTEN may interfere with the cell cycle of ovarian cancer cells and inhibit their growth and proliferation， which may provide a new method for gene therapy of ovarian serous adenocarcinoma. WWOX and PTEN gene deletion may be an important molecular basis for the development of ovarian serous adenocarcinoma. Clinical research needs to be further explored in terms of gene molecular regulation.

[Key words] Serous adenocarcinoma； Tumor suppressor gene； WWOX； PTEN

卵巢漿液性腺癌發(fā)病率居我國婦科惡性腫瘤前列，是卵巢上皮性癌中最常見的組織學(xué)類型。目前卵巢漿液性腺癌有逐年增高的趨勢。不同級(jí)別的卵巢漿液性腺癌其發(fā)生機(jī)制可能不同，而在多種腫瘤發(fā)生中，WWOX及PTEN均表達(dá)下降或缺失，參與了腫瘤的形成[1]。該研究通過檢測卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的表達(dá)情況，探討卵巢癌基因治療的新靶點(diǎn)并探討其對(duì)預(yù)后的可能影響，方便選取2013年10月—2016年10月福州市第一醫(yī)院的手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的60例卵巢漿液性腺癌標(biāo)本為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取福州市第一醫(yī)院的手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的60例卵巢漿液性腺癌標(biāo)本?；颊吣挲g在 34～72歲之間，平均年齡 50歲。另選取正常卵巢組織30例作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 試劑 WWOX（C7）小鼠抗人單克隆抗體（稀釋度1：100）和PTEN（6H2.1） 小鼠抗人單克隆抗體（稀釋度1：100）分別購自 Santa Cruz 公司和福州邁新公司。

1.2.2 免疫組化 免疫組化染色采用 EliVision兩步法。按試劑盒說明書的具體操作步驟進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，以正常卵巢組織作陽性對(duì)照。其中以蘇木精輕度復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察。

1.2.3 結(jié)果判定 WWOX染色 以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，PTEN染色：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。以陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)>75%計(jì)為4分，陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%計(jì)為3分，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%計(jì)為2分，陽性細(xì)胞數(shù)<25%計(jì)為1分，沒有陽性細(xì)胞計(jì)為0分。以每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色特征來決定染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)棕黃色顆粒為3分，出現(xiàn)黃色顆粒為2分，出現(xiàn)淡黃色顆粒為1 分，無染 色為0分。兩項(xiàng)結(jié)果相加：0分：（-），2～3分：（+），4～5分：（++），6～7分：（+++）；（ +～+++）均為陽性。endprint

1.2.4 RT-PCR 采用異硫酸氰酸胍一步法提取組織總RNA；總RNA的鑒定；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR反應(yīng)；采用凝膠分析軟件（BIO-LD）進(jìn)行定量，各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，計(jì)量資料比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，并分別用（x±s）、[n（%）]表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX 在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)

檢測結(jié)果顯示，30例正常卵巢組織中WWOX免疫組化陽性化表達(dá)為90.0%（27/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中WWOX 免疫組化陽性率（48.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。半定量 RT-PCR結(jié)果顯示卵巢漿液性腺癌中WWOX mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.23±0.05）顯著低于正常卵巢組織組（0.58±0.07）（P<0.05），見表1、圖1。

2.2 PTEN在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)

PTEN的 免疫組化檢測結(jié)果顯示，30例正常卵巢組織中PTEN免疫組化陽性化表達(dá)為93.3%（28/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中PTEN陽性率（50.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。卵巢漿液性腺癌中 PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.04），顯著低于正常卵巢組織組的（0.61±0.06）（P<0.05），見表2、圖2。

3 討論

近年來腫瘤研究中的熱點(diǎn)為癌基因的激活和抑癌基因的失活，而卵巢漿液性腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，具有預(yù)后差，病死率高的特點(diǎn)，因此該疾病一直是醫(yī)護(hù)人員關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。2000年，由Bednarek應(yīng)用鳥槍基因測序技術(shù)分離并鑒定出了一種WWOX基因，其基因定位于人類16q23.3～24.1的染色體上，且對(duì)整個(gè)常見染色體脆性位點(diǎn)FRA16D進(jìn)行了跨越，蛋白質(zhì)編碼共包含羧基末端的1個(gè)短鏈脫氧/還原酶結(jié)構(gòu)域（SDR）和氨基端的2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域[3]。WWOX抑癌基因通過使酪氨酸33位點(diǎn)磷酸化而致功能活化，下調(diào)凋亡抑制因子，同時(shí)上調(diào)p53基因蛋白表達(dá)，使TNF細(xì)胞毒作用進(jìn)行增強(qiáng)，并形成復(fù)合物，從而相互作用，起到抑制癌細(xì)胞的作用[4-6]。Nunez等[7]研究中顯示，正常卵巢組織中WWOX抑癌基因始終為強(qiáng)陽性表達(dá)，而卵巢癌中不僅組織分型中存在差異，且至少有37%減少或無法檢測出。該次研究結(jié)果顯示，30例正常卵巢組織中WWOX免疫組化陽性化表達(dá)為90.0%（27/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中WWOX 免疫組化陽性率（48.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），卵巢漿液性腺癌中WWOX的免疫組化陽性率及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于正常卵巢組織組，半定量 RT-PCR結(jié)果顯示卵巢漿液性腺癌中WWOX mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.23±0.05）顯著低于正常卵巢組織組（0.58±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為WWOX基因表達(dá)缺失或降低可能在卵巢漿液性腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因之一[8]。主要表現(xiàn)為基因缺失、蛋白表達(dá)減少，可通過DNA甲基化以及基因突變等方式失活，調(diào)控細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重 要作用[9]，因此PTEN基因失活在卵巢癌的發(fā)生中可能起一定的作用，可以認(rèn)為PTEN 基因下調(diào)可能是卵巢癌發(fā)生的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究也表明，卵巢漿液性腺癌中PTEN基因的免疫組化陽性率及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于正常卵巢組織組（P<0.05）。因此，該研究認(rèn)為PTEN基因失活與卵巢癌的發(fā)生存在一定的重要關(guān)聯(lián)。

綜上所述，抑癌基因WWOX及PTEN可能會(huì)干擾卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期并抑制其生長增殖，臨床研究有待從分子調(diào)控等方面進(jìn)一步深入探討，以期為今后的卵巢漿液性腺癌基因防治提供新的作用靶點(diǎn)，為卵巢漿液性腺癌的基因治療提供一種新方法。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2017-08-25）endprint