預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對大鼠缺血再灌注損傷的保護作用

張濤+許文勝+郝冬梅+何宏偉+單新亮+李鑫瑤+孫旭+高彩鳳

[摘要] 目的 探討預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 該實驗于2015年10月—2016年9月進行。選取清潔級雄性SD大鼠50只，體重（270±30）g（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動物中心提供，合格證號：201407413，ddY系SPF級）；隨機分為假手術(shù)組、模型組、預(yù)適應(yīng)組、后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組，每組10只，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均制作為腦缺血/再灌注損傷模型，在再灌注48 h后，檢測各組大鼠神經(jīng)功能、腦梗死灶體檢、腦組織氧化應(yīng)激損傷生化指標(biāo)及神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果 再灌注12、24 h和48 h模型組神經(jīng)功能缺陷評分（3.10±0.23）分、（3.53±0.15）分、（3.32±0.16）分明顯高于其他處理組（P<0.05）；再灌注12、24 h和48 h處理組中，預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺陷評分最低（1.89±0.11）分、（1.75±0.12）分、（1.22±0.13）分（P<0.05）；預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組腦梗死灶體積為（100.41±33.26）mm3，明顯低于模型組、預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組（P<0.05）；預(yù)適應(yīng)組（182.43±50.10）mm3和后適應(yīng)組（185.10±52.33）mm3腦梗死灶體積較模型組（100.41±33.26）mm3降低（P<0.05）；假手術(shù)組超氧化物歧化酶（SOD）活性（122.41±24.61）μn/mgprot明顯高于模型組（45.56±10.31）μn/mgprot，而丙二醛（MDA）（43.51±9.64）nmol/mgprot低于模型組（113.43±21.07）nmol/mgprot（P<0.05）；后適應(yīng)組（76.81±9.83）μn/mgprot和預(yù)適應(yīng)后適應(yīng)組SOD活性較模型組升高（110.13±12.16）μn/mgprot，而MDA（61.51±12.15）nmol/mgprot較模型組（113.43±21.07）nmol/mgprot降低（P<0.05）；假手術(shù)組細胞凋亡數(shù)（15.20±7.62）個明顯低于模型組（84.11±8.42）個（P<0.05）；各處理組細胞凋亡數(shù)較模型組有所降低（73.04±9.01）個、（61.12±10.17）個（P<0.05），其中預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)最少，為（47.20±9.21）個。結(jié)論 預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均能對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，而兩者聯(lián)合應(yīng)用能進一步加強保護作用。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注損傷；預(yù)適應(yīng)；后適應(yīng)；大鼠

[中圖分類號] R285 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）10（c）-0006-05

Protective Effects of Preconditioning Combined with Post Adaptation on Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury in Rats

ZHANG Tao， XU Wen-sheng， HAO Dong-mei， HE Hong-wei， SHAN Xin-liang， LI Xin-yao， SUN Xun， GAO Cai-feng

Research Room of Immunology， School of Basic Medical and Forensic Medicine， Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia， 014040 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate protective effects of preconditioning combined with post adaptation on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats. Methods The experiment was implemented from October 2015 to September 2016. 50 clean grade male SD rats were selected weight for （270±30）g （provided by Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou Medical College Animal Center， certificate number： 201407413， ddY department， SPF grade）， the rats were randomly divided into sham operation group， model group， pre-adaptation group， post adaptation group and preconditioning + post adaptation group， with 10 rats in each group， except sham operation group， other groups were made into cerebral ischemia / reperfusion injury model， after 48h of reperfusion， each groups rat neurological function was detected， cerebral infarction， brain tissue oxidative stress injury biochemical indicators and neuronal apoptosis in rats were observed. Results Reperfusion for 12， 24 h and 48 h， the model group of nerve function defect score was（3.10±0.23）points，（3.53±0.15）points，（3.32±0.16）points， significantly higher than that of other groups（P<0.05）； Reperfusion for 12， 24 h and 48 h， preconditioning + post adaptation group neural function defect score was （1.89±0.11）points，（1.75±0.12）points， （1.22±0.13）points， （P<0.05）； the preconditioning group + postconditioning group was（100.41±33.26）mm3， which was significantly lower than that in the model group， and the preconditioning group and the postconditioning group （P<0.05）. The pretreatment group was （182.43±50.10）mm3 and the postconditioning group was （185.10±52.33）mm3 and the model group was （100.41±33.26）mm3 （P<0.05）. The activity of superoxide dismutase （SOD） was （122.41±24.61）μn/mgprot in sham operation group， significantly higher than that in model group of（45.56±10.31）μn/mgprot， while that of malondialdehyde （MDA） was （43.51±9.64）nmol/mgprot， significantly lower than that in model group of（113.43±21.07）nmol/mgprot（P<0.05）， the post adaptation group was （76.81±9.83）nmol/mgprot， and the preconditional group±The activity of SOD in the postconditioning group was（110.13±12.16）μn/mgprot， MDA was（61.51±12.15）nmol/mgprot， lower than the model group of （113.43±21.07）nmol/mgprot，（P<0.05）； The number of apoptotic cells in sham operation group was （15.20±7.62）， significantly lower than that in model group of （84.11±8.42） （P<0.05）. The number of apoptotic cells in each treatment group was significantly lower than that in model group of （73.04±9.01），（61.12±10.17）（P<0.05）， and the number of neurons in the pretreatment group was the lowest of （47.20±9.21）. Conclusion Preconditioning and post adaptation can protect the cerebral ischemia / reperfusion injury in rats， and the combined application of the two methods can further strengthen the protective effect.endprint

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion injury； Preconditioning； Post adaptation； Rat

腦缺血再灌注損傷主要是指恢復(fù)缺血腦組織的血流灌注對腦組織造成的嚴重損傷，其可引起一系列的細胞和生理反應(yīng)，如產(chǎn)生大量氧自由基等活性分子、誘導(dǎo)前列腺素合成、誘導(dǎo)活化信號分子和誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生等，導(dǎo)致線粒體功能障礙等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。而缺血預(yù)適應(yīng)主要是指短暫缺血再灌可增強腦組織對隨后較長時間缺血損傷的耐受性的現(xiàn)象，缺血后適應(yīng)主要是指在腦缺血后再灌早期采用反復(fù)數(shù)次短暫缺血再灌可保護腦組織以防止再灌注損傷，二者均可調(diào)動細胞內(nèi)源性保護機制，進而抵抗神經(jīng)細胞損傷，但具體作用機制目前尚不完全清楚[3-4]。為了進一步討預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用，該研究于2015年10月—2016年9月將50只SD大鼠[內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動物中心提供，合格證號：201407413，ddY系SPF級，（270±30）g]，制作腦缺血/再灌注損傷模型后的神經(jīng)功能、腦梗死灶體檢、腦組織氧化應(yīng)激損傷生化指標(biāo)及神經(jīng)元凋亡情況進行了檢測分析，并與正常大鼠進行了比較，為臨床上提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

該實驗于2015年10月—2016年9月進行。選取清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量240～300 g，均由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動物中心提供，合格證號：201407413，ddY系SPF級。將大鼠隨機分為5組，每組10只：假手術(shù)組（僅分離大鼠頸部血管，不插線栓）、模型組（線栓法行大腦中動脈阻閉120 min后再灌注）、預(yù)適應(yīng)組（在造模前24 h和1 h行3個循環(huán)的缺血15 s+再灌注30 s）、后適應(yīng)組（在造模后行3個循環(huán)的再灌注30 s+缺血15 s）和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組（在造模前24 h和1 h行3個循環(huán)的缺血15 s再灌注30 s以及在造模后行3個循環(huán)的再灌注30 s+缺血15 s）。

1.2 儀器與試劑

精密電子天平（DV215CD）購自日本奧豪斯公司；高速離心機（CRII）購自日本日立公司；數(shù)碼相機（A-550）購自日本SONY公司，彩色病理圖文分析系統(tǒng)（HPIAS-1000）購自武漢千屏影像公司，紫外分光光度計（UV-2550）購自日本島津儀器公司，顯微鏡（Ls-210）購自日本奧林巴斯公司。丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒購自北京中金杉生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自德國Roche公司；氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備

所有實驗大鼠在術(shù)前均禁食12 h，自由飲水，隨后行大腦中動脈阻閉120 min后再灌注造成局灶性腦缺血再灌注損傷模型，具體造模方法如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后頸部備皮、消毒，在頸正中做長約1.5 cm切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠心端及頸內(nèi)動脈的顱外分支翼腭突動脈。利用動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈遠心端，防止血液返流，隨后在頸外動脈近分叉處剪一切口，經(jīng)頸外動脈將線栓插入頸內(nèi)動脈，松開頸內(nèi)動脈遠心端的動脈夾后繼續(xù)插入線栓，直至到達大腦前動脈近端壁，阻斷大腦中動脈來自頸內(nèi)動脈、大腦前動脈及大腦后動脈的所有血供。去除頸總動脈上的動脈夾，依次縫合肌肉和皮膚切口，但將線栓外留。阻斷120 min后再次麻醉動物，將線栓緩慢拔出，恢復(fù)血流再灌注。假手術(shù)組僅分離頸內(nèi)動脈和頸外動脈，不插線栓。

1.4 預(yù)適應(yīng)與后適應(yīng)處理

預(yù)適應(yīng)方法：預(yù)適應(yīng)組大鼠和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組大鼠在造模前24 h和1 h分別行3個循環(huán)的大腦中動脈缺血15 s+再灌注30 s作為預(yù)適應(yīng)，即阻斷大腦中動脈15 s后拔出線栓再灌注30 s，重復(fù)3個循環(huán)。后適應(yīng)方法：后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組大鼠在造模后拔出線栓再灌注30 s，然后將線栓再次插入頸內(nèi)動脈阻閉大腦中動脈15 s，重復(fù)3個循環(huán)后進行持續(xù)再灌注48 h。

1.5 腦梗死灶測定

各組于造模48 h后隨機取4只處死后斷頭取腦，除去嗅球、小腦和低位腦干部分后切成約2 mm厚腦片，迅速放入氯化三苯基四氮唑溶液（TTC）中37℃染色30 min，正常組織可被TTC染為深紅色，而缺血壞死的腦組織不與TTC反應(yīng)，應(yīng)為白色。將切片多聚甲醛固定后放置比例尺并拍照，利用圖像處理軟件描繪出每一層面染色成白色的區(qū)域后，按比例求出各腦片的梗死面積（紅色區(qū)域為正常腦組織，白色區(qū)域為梗死區(qū)）。

1.6 腦組織勻漿生化指標(biāo)測定

各組再隨機取4只大鼠斷頭后取腦，去除小腦和嗅球后用冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干后稱重，隨后加入等體積預(yù)冷的生理鹽水后利用勻漿機制成勻漿，高速離心機以6 000 r/min離心15 min后取上清液，于冰箱保存待測。

取少量上清液分別加入考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒進行處理，并利用紫外分光光度計分別在590、550 nm和532 nm處測定吸光度，根據(jù)公式求出樣本中蛋白質(zhì)濃度、SOD活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 細胞凋亡測定

將各組剩余的大鼠麻醉后先經(jīng)心臟灌注生理鹽水，把血液沖凈后再用4%多聚甲醛灌注，隨后斷頭取腦，將缺血側(cè)腦組織用4%多聚甲醛進行固定。常規(guī)脫水和石蠟包埋處理，在視交叉后1 mm處及4 mm處行冠狀切片后做連續(xù)切片，厚約5 μm。將相鄰大腦切片用TUNEL試劑盒進行染色后于顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。陽性細胞結(jié)果應(yīng)為棕黃色（核）或棕褐色，背景呈藍紫色，每張切片在普通光鏡鏡下隨機釆集5個不重疊視野進行觀察，記錄每個視野中的調(diào)亡細胞個數(shù)，取平均值作為調(diào)亡細胞數(shù)。endprint

1.8 神經(jīng)功能缺陷評分

采用Longa等描述的5級神經(jīng)缺陷評分法對大鼠手術(shù)后再灌注6、12、24 h和48 h神經(jīng)功能進行評分：0級為無神經(jīng)功能缺陷，記為0分；Ⅰ級為不能完全伸展缺血病灶對側(cè)前肢，記為1分；Ⅱ級為行走時向缺血病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈，記為2分；Ⅲ級為行走時向缺血病灶對側(cè)傾倒，記為3分；Ⅳ級為不能自發(fā)行走，昏迷，記為4分。

1.9 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)整理分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較使用方差檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

再灌注后6 h各處理組與模型組神經(jīng)功能缺陷評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；再灌注12、24 h和48 h模型組神經(jīng)功能缺陷評分明顯高于其他處理組（P<0.05）；再灌注12、24和48 h處理組中，預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺陷評分最低（P<0.05），而預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺失評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠腦梗死灶體積比較

預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組腦梗死灶體積為（100.41±33.26）mm3，明顯低于模型組、預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組（P<0.05）；預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積較模型組降低（P<0.05）；預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織SOD和MDA比較

假手術(shù)組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組（P<0.05）；模型組與預(yù)適應(yīng)組SOD和MDA比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低（P<0.05）。見表3。

2.4 各組皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡影響

假手術(shù)組細胞凋亡數(shù)明顯低于模型組（P<0.05）；各處理組細胞凋亡數(shù)較模型組有所降低（P<0.05），其中預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)最少，為（47.20±9.21）個。見表4、圖1。

3 討論

腦是人體對缺血最為敏感的器官，腦組織缺血將會導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害，即使短暫的缺血也可導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或死亡，而長時間的完全缺血或嚴重缺血會引起梗死[5]。缺血后血流恢復(fù)無疑是維持和防止腦組織進一步損傷的必需措施，但再灌注后往往發(fā)生復(fù)雜的腦循環(huán)機能和代謝的變化，加重缺血后的腦組織損傷，常表現(xiàn)于圍術(shù)期腦外傷及頭頸部大血管手術(shù)[6]。腦缺血時腦細胞生物電會發(fā)生改變，并出現(xiàn)病理性慢波，缺血一定時間后再灌注，慢波持續(xù)并加重，而顳葉組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)性氨基酸代謝也會發(fā)生明顯變化，即興奮性氨基酸隨缺血-再灌注時間延長而逐漸降低，抑制性氨基酸在缺血-再灌注早期明顯升高。缺血再灌注損傷時間越長，興奮性遞質(zhì)含量越低，腦組織超微結(jié)構(gòu)改變越明顯，但其具體機制目前尚不完全清楚[7-8]。

該研究將SD大鼠制作腦缺血/再灌注損傷模型后的神經(jīng)功能、腦梗死灶體檢、腦組織氧化應(yīng)激損傷生化指標(biāo)及神經(jīng)元凋亡情況進行了檢測分析，并與正常大鼠進行了比較，為臨床上提供了理論依據(jù)。研究結(jié)果表明，再灌注12、24 h和48 h模型組神經(jīng)功能缺陷評分明顯高于其他處理組，再灌注12、24 h和48 h處理組中，預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺陷評分最低，而預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺失評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)可明顯改善腦缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能下降程度，且比單獨預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)的效果更好。同時發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組；模型組與預(yù)適應(yīng)組SOD和MDA比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低。SOD可清除超氧陰離子，其活性的下降則意味著機體抗氧化能力的降低；而MDA的含量變化可間接反映腦組織中ROS含量的變化和腦組織的損傷程度，而后適應(yīng)可明顯上調(diào)SOD水平并降低MDA水平，進而抑制ROS的爆發(fā)，其抗氧化作用較強。研究還發(fā)現(xiàn)，各處理組細胞凋亡數(shù)較模型組有所降低，其中預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)最少，而預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組腦梗死灶體積明顯低于模型組、預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組，預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積較模型組也明顯降低，提示預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均可明顯改善腦組織的損傷程度，進而抑制再灌注期的氧化應(yīng)激損傷，從而減少神經(jīng)細胞的調(diào)亡與壞死，但聯(lián)合后的保護效果更好。但該研究限于研究樣本的不足，對于預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用的具體機制仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均能對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，而兩者聯(lián)合應(yīng)用能進一步加強保護作用。

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（收稿日期：2017-07-22）endprint