ELISA法和RT—PCR法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用對(duì)比

廖秀海

【摘要】 目的：對(duì)比分析酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用。方法：由本市各醫(yī)院采集并送至本中心接受麻疹病毒檢測的50例疑似麻疹患者為研究對(duì)象，所有患者標(biāo)本均采用ELISA法和RT-PCR法進(jìn)行麻疹病毒檢測。對(duì)比兩種檢測方式在不同出疹時(shí)間段所取標(biāo)本的陽性率、檢測水平。結(jié)果：在50例疑似麻疹患者中，ELISA法檢測麻疹病毒IgM抗體陽性22例，IgM抗體陰性28例，陽性率為44.00%；RT-PCR法檢測，麻疹病毒IgM抗體陽性26例，IgM抗體陰性24例，陽性率為52.00%，兩種檢測方式陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?；颊叱稣畹?天收集的標(biāo)本，采用ELISA法檢測陽性率為60.00%，采用RT-PCR法檢測陽性率為80.00%。隨著患者采樣時(shí)間不斷改變，兩種檢測方式的陽性率均逐漸降低，兩種方法檢測的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。50例麻疹疑似患者同一時(shí)間段采集血清和咽拭子標(biāo)本，24例患有免疫史，不伴隨有免疫史亦或者是不詳?shù)墓?6例。結(jié)論：RT-PCR法適用于出疹時(shí)間在2 d之內(nèi)疑似麻疹患者的臨床診斷中，而ELISA法則適合使用在出疹時(shí)間在2 d或以上疑似麻疹患者的臨床檢測中。

【關(guān)鍵詞】 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法； 麻疹病毒

【Abstract】 Objective：To observe and compare the application of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR） in the detection of measles virus.Method：Fifty patients collected from hospitals in our city and sent to our center for measles virus test were selected as research objects，all patients were tested for measles virus by ELISA and RT-PCR.Compared the positive rate and the level of the specimens taken by the two methods at different rash time.Result：A total of 22 cases of measles were positive for measles virus and 28 cases were negative for measles virus，the positive rate was 44.00%.In total，26 cases of measles virus IgM antibody，24 cases of negative measles virus IgM antibody，the positive rate was 52.00%.There was no significant difference in the positive rate of the two detection methods（P>0.05）.When the samples were collected on the first day of the test by ELISA，the positive rate was 60.00%，when the specimens collected on the first day of the test were detected by RT-PCR，the positive rate was 80.00%.With the continuous change of sampling time，the positive rates of the two test methods decreased gradually，there were no significant differences in the positive rate of the two methods（P>0.05）.Serum and throat swab samples were collected in the same period of 50 suspected cases of measles，24 cases had a history of immunization，without a history of immunization or an unknown total of 26 cases.Conclusion：The RT-PCR method is suitable for the clinical diagnosis of measles patients with measles within two days，while the ELISA method is suitable for the clinical test of patients with suspected measles two or more days.

【Key words】 ELISA； RT-PCR； Measles virus

First-authors address：Xinyu City Center for Disease Control and Prevention，Xinyu 338000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.36.026

麻疹病毒屬于麻疹的病原體，一旦不小心感染這種病原體就會(huì)有很大的可能誘發(fā)以發(fā)熱、出疹為主要癥狀表現(xiàn)的急性病毒性呼吸道傳染病，該病的發(fā)病率非常高，具有極強(qiáng)的傳染性。目前，麻疹病毒已經(jīng)被歸納進(jìn)我國計(jì)劃免疫病毒之一[1-2]。由于麻疹病毒的感染速度非?？欤猿跗诮o予疑似麻疹患者實(shí)施有效的診斷是至關(guān)重要的，并且一旦確診就必須要立即選用相應(yīng)的防治措施進(jìn)行預(yù)防，從而有效降低麻疹暴發(fā)率[3]。本文通過探究酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用，得出如下結(jié)論。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)抽取2015年1月-2016年12月由新余市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行麻疹病毒檢測的50例疑似麻疹患者為研究對(duì)象，所有患者均采用ELISA法和RT-PCR法進(jìn)行麻疹病毒檢測。其中，男35例，女15例；年齡6～14歲，平均（9.28±1.26）歲。于患者出疹時(shí)間14 d內(nèi)抽取血標(biāo)本，采用ELISA法檢測血清中麻疹特異性IgM抗體；患者出疹第5天后，采集咽拭子標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測麻疹病毒的核酸。此外，使用ELISA法和RT-PCR法共同檢測標(biāo)本中存在的風(fēng)疹病毒，利用這兩種檢測方式排除風(fēng)疹病毒，以免其對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生不良的影響[4]。

1.2 儀器與試劑 安圖-2010酶標(biāo)儀；ABI7300熒光定量PCR儀；麻疹病毒IgM抗體檢測試劑盒（生產(chǎn)商家：珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：YZB/國6817-2012）；RNA提取試劑盒：QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit試劑盒（Cat∶74106）；熒光RT-PCR試劑盒：廣州達(dá)安基因公司的流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，Cat：#DA-BN238）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 抽取全部患者靜脈血，每例患者抽取的血量均為2～3 mL，然后將收集的靜脈血送至實(shí)驗(yàn)室實(shí)施離心措施，離心時(shí)間最好保持在20 min左右，離心結(jié)束后選取上層血清，將其放置于2～8 ℃的環(huán)境下冷藏備用。同時(shí)選取病毒采樣管拭子頭于患者咽喉位置進(jìn)行擦拭，以收集該位置的上皮細(xì)胞，最后將拭子頭放置進(jìn)采樣液之中，將標(biāo)本放置于2～8 ℃的環(huán)境下進(jìn)行冷藏備用[5-6]。

1.3.2 ELISA法檢測血清中麻疹I(lǐng)gM 在給予患者的血液樣本實(shí)施麻疹病毒IgM抗體檢測時(shí)，在操作試劑盒的過程中可以根據(jù)說明書上所寫的操作操作步驟來實(shí)施，并且在專門設(shè)定一個(gè)空白對(duì)照孔，同時(shí)對(duì)其添加任何一種液體；再然后分別于陰性、陽性兩個(gè)位置設(shè)定2個(gè)對(duì)照孔，接下來再根據(jù)100 μL/孔使用相應(yīng)的對(duì)照液添加進(jìn)陰性、陽性；而在樣品孔方面，可以結(jié)合100 μL/孔，再使用10 μL待測血清、標(biāo)本稀釋液兩種不同類型的液體依次加入。此外，為了能夠降低風(fēng)疹病毒所造成的干擾，在進(jìn)行檢測的過程中使用風(fēng)疹病毒IgM抗體檢測試劑盒對(duì)全部患者的血清樣本實(shí)施風(fēng)疹病毒IgM檢測。

1.3.3 RT-PCR法檢測病毒核酸 首先對(duì)全部的患者實(shí)施咽拭子收集，可以使用消毒過后的無菌棉簽浸濕患者咽部位置少量的分泌物，收集人員在采集的過程中最好盡量避開患者的口腔內(nèi)部的黏膜、唾液、舌頭等組織和液體[7]。采集成功之后將其放置進(jìn)容量為3～5 mL的病毒標(biāo)本保存液進(jìn)行貯存，于標(biāo)本袋的頂端位置將棉簽折斷，再使用柱式病毒RNAout試劑盒提取RNA，使用于后續(xù)的擴(kuò)增措施。其次再對(duì)患者進(jìn)行RT-PCR法檢測，在進(jìn)行檢測的過程中檢測人員可以結(jié)合麻疹病毒RNA檢測試劑盒所提供的說明書上的具體操作步驟實(shí)施檢測，進(jìn)行安置反應(yīng)體系成功之后，在PCR儀實(shí)施擴(kuò)增措施，具體的反應(yīng)條件包含有以下幾點(diǎn)：（1）逆轉(zhuǎn)錄：溫度為50 ℃，時(shí)間為15 min，循環(huán)次數(shù)為1個(gè)；（2）預(yù)變性：溫度為95 ℃，時(shí)間為15 min，循環(huán)次數(shù)為1個(gè)；（3）退火、變性、延伸：溫度為94 ℃，時(shí)間為15 s，循環(huán)次數(shù)為40個(gè)；（4）當(dāng)溫度為55 ℃，開始對(duì)全部的熒光信號(hào)進(jìn)行收集[8]。

1.4 實(shí)驗(yàn)室患者確診定義 結(jié)合中國麻疹、風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室指定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，疑似患者中麻疹特異性IgM抗體檢測陽性、麻疹核酸RNA陽性、特異性IgM抗體、核酸RNA均為陽性，即能夠?qū)⑵湓\斷為實(shí)驗(yàn)室患者確診[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方式的檢出陽性情況 50例疑似麻疹患者同一時(shí)間段采集血清、咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測，使用ELISA法進(jìn)行檢測，總共有22例麻疹病毒IgM抗體陽性，28例麻疹病毒IgM抗體陰性，陽性率為44.00%；而使用RT-PCR法進(jìn)行檢測，總共有26例麻疹病毒IgM抗體陽性，24例麻疹病毒IgM抗體陰性，陽性率為52.00%。兩種檢測方式的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.93，P>0.05）。見表1。

2.2 不同時(shí)間段收集的標(biāo)本兩種檢測方式檢測結(jié)果比較 本研究是通過患者的出疹時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)而設(shè)定其實(shí)施采樣時(shí)間，將患者出疹第1天設(shè)定采集時(shí)間為0 d，采用ELISA法檢測陽性率為60.00%，采用RT-PCR法檢測陽性率為80.00%。隨著患者采樣時(shí)間不斷改變，兩種檢測方式的陽性率均逐漸降低，兩種方法檢測的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 不同免疫史標(biāo)本的檢測情況 50例麻疹疑似患者同一時(shí)間段采集血清和咽拭子標(biāo)本，24例患有免疫史，不伴隨有免疫史或是不詳?shù)墓?6例。

3 討論

作為出疹類可傳染疾病的一種，麻疹在出現(xiàn)疹子的前后5 d都會(huì)帶有比較強(qiáng)烈的傳染性，值得注意的是，麻疹病毒的攜帶者及隱形感染者比較少見，麻疹病毒一般從患者呼吸道分泌物或血液中分離出，所以在醫(yī)學(xué)上更重視對(duì)患者的早期診斷、觀察與隔離[10-11]。經(jīng)過醫(yī)學(xué)發(fā)展及研究人員的努力，現(xiàn)如今ELISA法與RT-PCR法是常用的針對(duì)麻疹的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。這兩種檢測方式均具有快速、靈敏以及易操作等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。本研究應(yīng)用ELISA法和RT-PCR法同一時(shí)間段采集50例疑似麻疹患者的血清、咽拭子兩種標(biāo)本，ELISA法和RT-PCR法對(duì)患者標(biāo)本核酸進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但是RT-PCR法比ELISA性多檢出5例，說明熒光PCR法靈敏度稍高于ELISA。endprint

文獻(xiàn)[14-16]研究表明，熒光PCR的敏感度高于血清ELISA。熒光PCR可以在發(fā)熱僅1 d的小兒樣本中檢測出麻疹病毒，而且還可通過熒光PCR法對(duì)于一些血清IgM抗體呈陰性的患者進(jìn)行進(jìn)一步檢測，從而盡力實(shí)現(xiàn)無漏檢的目的。另有研究結(jié)果顯示采血時(shí)間的不同也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成頗大的影響。歐陽霖等[17]對(duì)不同采血時(shí)間進(jìn)行研究顯示，出疹后第1～3天ELISA法檢測麻疹病毒特異性IgM抗體陽性率在30.70%～44.70%，至出疹后第8天達(dá)到87.10%。而在本研究中，出疹后當(dāng)天ELISA法檢測麻疹病毒特異性IgM抗體陽性率在60.00%，出疹8 d后ELISA法檢測麻疹病毒特異性IgM抗體陽性率在33.33%，經(jīng)分析，這可能與采樣數(shù)量及病例的個(gè)體差異導(dǎo)致體內(nèi)抗體水平差異有關(guān)。

因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度及準(zhǔn)確度高、快速及操作簡單等一系列優(yōu)點(diǎn)，在處置麻疹疫情過程中，大概在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可得到實(shí)驗(yàn)室確診[18]。與傳統(tǒng)PCR檢測方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測麻疹病毒核酸克服了假陽性、靈敏度不高等諸多問題，且其操作方法更簡單便捷，不用經(jīng)過PCR后處理，結(jié)果直觀，避免了人為判斷，從核酸提取至完成檢測整個(gè)過程僅需3 h左右。但在實(shí)際操作中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所需要的儀器較為昂貴，試劑耗材等相關(guān)費(fèi)用也較高，且實(shí)驗(yàn)室生物安全要求也相對(duì)較高，并未在縣（區(qū)）級(jí)醫(yī)院和縣疾控中心全部配備完成[19-20]。所以從實(shí)際考慮，對(duì)于邊遠(yuǎn)地區(qū)而言，ELISA法檢測顯然更適合用來確診病例。

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（收稿日期：2017-12-06） （本文編輯：張爽）endprint