養(yǎng)豬廢水處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)變化及影響因素研究

翟一帆,袁青彬,胡 南

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)中復(fù)雜的微生物種群對處理效果和后續(xù)出水安全性具有顯著影響。據(jù)報道,養(yǎng)殖廢水的微生物主要有硝化螺菌屬、芽單孢菌屬、子囊菌門等[13],另外還存在彎曲桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌[14-16]。目前對養(yǎng)殖廢水處理過程中真菌類群的種類及其豐度變化的研究極少。另外,廢水處理系統(tǒng)中微生物種類可能受到多種因素的影響[17],從而對處理效果造成顯著影響,但目前對養(yǎng)殖廢水微生物的相關(guān)研究報道也很少。定量表征養(yǎng)殖廢水處理過程中微生物種群變化的影響因素,對揭示微生物種群變化規(guī)律具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

樣本取自宿遷市沭陽縣某養(yǎng)豬場廢水處理系統(tǒng),該養(yǎng)豬場的生豬養(yǎng)殖規(guī)模約10 000頭,廢水排放量為150 m3/d。養(yǎng)豬場污水處理工藝經(jīng)厭氧-缺氧-好氧塘處理后排放。取樣時間為2015年8月中旬,取樣點位包括進水口、厭氧池、缺氧池、好氧曝氣池和出水口。每個點位廢水取4 000 mL置于5 000 mL無菌PV瓶,取樣后密封放入冰桶中,4 h內(nèi)運至實驗室進行后續(xù)分析。

1.2 微生物群落分析

1.2.1 DNA提取

收集的水樣通過0.22 μm微孔濾膜進行過濾,濾膜剪碎后置于DNA提取管。采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(OMEGA)土壤DNA提取試劑盒進行提取,提取過程參照操作說明書進行。提取的DNA用瓊脂糖凝膠電泳 (Biolab,USA)進行鑒定,并用微量分光光度計(NanoDrop 8000, NanDrop Technologies, Willmington, USA)測定濃度。

1.2.2 高通量測序

將提取的DNA樣品為PCR擴增細菌的16S和真菌的18S,引物為細菌:515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),真菌:ITS1F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR 采用TransStartFastpfu DNA Polymerase,20 μL反應(yīng)體系:4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/LdNTP,0.8 μL正向和反向引物(5 μmol/L),0.4 μLFastPfu Polymerase,1 μL DNA,補ddH2O至總體積為20 μL。PCR送至深圳恒創(chuàng)基因有限公司,采用Illumina MiSeq高通量DNA測序平臺進行測序。測序數(shù)據(jù)通過GreenGene(16S、葉綠體、線粒體), RDP(16S), Silva(18S), Unite(ITS)數(shù)據(jù)庫比對獲得物種注釋信息(置信度閾值默認為0.8以上)。采用KRONA、Mega 4.0、BioEdit軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,采用UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)聚類分析方法構(gòu)建樣品的聚類樹。

1.3 水質(zhì)檢測

1.4 冗余性分析

使用Canoco 4.5研究微生物種群和水質(zhì)因子間的相關(guān)性。首先,對物種矩陣進行趨勢分析,得出第一排序軸長度相對較短(<4),所以選用線性模型冗余性分析法對物種組成數(shù)據(jù)與堆肥環(huán)境因子進行多元相關(guān)性分析;再采用手動選擇方式,用Monte Carlo permutation test檢驗顯著性,置換次數(shù)為999,找出顯著影響(P<0.05)和極顯著影響(P<0.01)菌群結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境因子;最后用Canodraw 4.5作圖,直觀展示相關(guān)性結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌群落的空間分布特征

對各點位細菌群落的監(jiān)測表明主要門類為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)等。其中變形菌門(Proteobacteria)最豐富,5個位點的平均相對豐度達55.56%；其次是厚壁菌門(Firmicutes)，5個位點的平均相對豐度達16.84%,擬桿菌門和放線菌門(Actinobacteria)平均相對豐度分別為11.97%和3.29%；其他含量較高的門類包括酸桿菌門(Acidobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠菌門(Chlorobi)、浮霉菌門(Planctomycetes)等。

進水中變形菌門相對豐度為56.74%,是最豐富的門類,從圖1可見,主要有弓形桿菌屬(arcobacter，0.96%)和不動桿菌屬(acinetobacter，1.06%。厚壁菌門其次(18.46%),從具體種屬看,主要有葡萄球菌屬(turicibacter)、SMB53、互營單孢菌屬(syntrophomonas)和消化鏈球菌屬(sedimentibacter),其含量分別為1.73%、0.67%、2.34%和3.02%。

圖1 養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)各位點細菌在屬分類的相對豐度

生物處理后,變形菌門在出水中含量顯著下降,相對豐度為41.03%。弓形桿菌屬(Arcobacter)在出水中的豐度較高。類似地,厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度同樣降至26.27%,擬桿菌門的相對豐度下降至8.19%?？赡苓@兩類細菌主要在生物處理單元發(fā)揮降解污染物質(zhì)的功能,從而在出水中相對豐度降低。相比之下,放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度增至12.98%,鹽單孢菌屬(Halomonas)和分支桿菌屬(Mycobacterium)等在出水中的相對豐度較高。這可能是因為放線菌門多為自養(yǎng)型,自身對營養(yǎng)物質(zhì)需求不高,所以出水中營養(yǎng)物質(zhì)降低,放線菌門的含量升高。

2.2 真菌群落的空間分布特征

養(yǎng)殖廢水系統(tǒng)各點位真菌共檢測到3個門、34個屬,分別為子囊菌門(Ascomycoka)(29.72%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)(9.8%)和少量壺菌門(Chytridiomycota).其中相對豐度較高的屬有支頂孢屬(Acremonium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、馬拉色霉菌屬(Malassezia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、輪枝孢菌屬(Verticillium)、單端孢屬(Trichothecium)、分子孢子屬(Cladosporium)、莖點霉屬(Phoma)和盤二孢菌屬(Marssonina)等。

進水中子囊菌門相對豐度為39.12%,是最豐富的門類,其中念珠菌屬占20.63%，支頂孢屬占3.79%；擔(dān)子菌門的相對豐度為18.75%,其中馬拉色霉菌屬占0.21%，紅酵母屬占2.40%，毛孢子菌屬占16.27%(圖2)。

圖2 養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)各位點真菌在屬分類的相對豐度

活性污泥中真菌群落相比進水發(fā)生顯著改變。子囊菌門仍為最主要的門類,但其含量在厭氧池和缺氧池中減少至22.27%,而在好氧池中其相對豐度上升至53.22%,這意味著在好氧池中有大量好氧真菌繁殖。值得注意的是,子囊菌門中曲霉菌屬(Aspergillus)在活性污泥中相對豐度為0.06%,據(jù)報道黃曲霉(aspergillusflavus)中的黃曲霉素對人體十分有害,少量可致死。從具體分布看,曲霉菌屬在厭氧池中的相對豐度尤為突出,幾乎是其他點位的2～3倍[27]。

另外,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)中的毛孢子菌屬(Trichosporon)、馬拉色霉菌屬(Malassezia)在厭氧池和缺氧池中相對豐度很小,而在好氧池中分別達19.26%、5.61%,據(jù)報道上述菌屬可導(dǎo)致人畜皮膚病的感染。枝孢子菌屬(Cladosporium)在厭氧池和缺氧池中相對豐度較高，達2.23%,但在好氧池中幾乎無檢出。枝孢子菌屬(Cladosporium)會導(dǎo)致麥類的黑變[28-29]。從真菌多樣性數(shù)據(jù)看,活性污泥S-H指數(shù)由進水的5.252降至3.292,表明多樣性程度顯著降低。

生物處理后出水中子囊菌門相對豐度顯著降低至9.94%。同樣地,擔(dān)子菌門的相對豐度降至4.17%。念珠菌屬、青霉菌屬、紅酵母屬等相對豐度也相應(yīng)降低。相比之下,小麥赤霉菌屬(Gibbrel)和盤二孢菌屬(Marssonina)在進水和活性污泥中未檢出,而在出水中相對豐度分別為2.16%和0.95%,這意味著養(yǎng)殖廢水經(jīng)處理后可能產(chǎn)生新的真菌類群,這可能和出水水質(zhì)條件變化有關(guān)。另外,出水中曲霉菌屬仍占0.34%～0.45%,馬拉色霉菌屬仍占1.22%～1.47%,青霉菌屬仍占0.93%～1.09%,毛孢子菌屬仍占1.52%～1.64%,這意味著養(yǎng)殖廢水中致病真菌可能排放到后續(xù)環(huán)境中，但目前國家暫未對水處理后致病菌的排放指標嚴格規(guī)定。

綜合上述研究發(fā)現(xiàn),不同的廢水處理階段優(yōu)勢菌屬不盡相同。處理后出水中的細菌群落和活性污泥中具有明顯差異。活性污泥處理對禽畜養(yǎng)殖廢水中的致病菌有顯著的減量作用,但是并不能徹底去除或降低至相對可忽略的水平，尤其出水中仍可檢出幾種致病真菌,其對后續(xù)生態(tài)環(huán)境和公共健康的影響不容忽視。

2.3 污水水質(zhì)對養(yǎng)豬廢水處理系統(tǒng)細菌和真菌群落分布的影響

表1 各點位的水質(zhì)指標值 mg/L

(a) 細菌

(b) 真菌

通過上述分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)豬污水的處理過程中眾多細菌和真菌群落的變化可能受水質(zhì)參數(shù)(主要是COD和氮)變化的明顯影響。對于養(yǎng)豬廢水處理,創(chuàng)造合理的生存條件,促進微生物特別是功能菌的增殖,最大程度發(fā)揮降解有機物和脫除氮的功能,可能是提高其處理效果的有效途徑。

3 結(jié) 論

畜禽廢水處理廠活性污泥中具有極其豐富的生物多樣性,細菌域中變形菌門(55.56%)、厚壁菌門(16.84%)、擬桿菌門(11.97%)和放線菌門(3.29%)豐度較高。變形菌門為活性污泥中最主要的門類,經(jīng)生物處理后,弓形桿菌屬、不動桿菌屬、芽孢桿菌等的相對豐度大幅度下降。在出水中,厚壁菌門中的芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬的相對豐度也有顯著降低。擬桿菌門的相對豐度同樣顯著下降。相比之下,放線菌門的相對豐度經(jīng)過生物處理后小幅增加,鹽單孢菌屬和分枝桿菌屬等的相對豐度在出水中相對較高。

在真菌域中子囊菌門(29.72%)、擔(dān)子菌門(9.8%)和壺菌門相對豐度較高。同時還在活性污泥中檢測到曲霉菌屬、葡萄球菌屬、馬拉色霉菌屬、盤二孢菌屬等能產(chǎn)生大量有害真菌的菌屬。生物處理后出水中子囊菌門、擔(dān)子菌門的相對豐度顯著降低。念珠菌屬、青霉菌屬、馬拉色霉菌屬、毛孢子菌屬、紅酵母屬等相對豐度也相應(yīng)降低。同時,在出水中還檢測出了新的菌屬，如小麥赤霉菌屬和盤二孢菌屬。從出水各個菌屬相對豐度看,活性污泥法處理養(yǎng)殖廢水并不徹底,曲霉菌屬、青霉菌屬、馬拉色霉菌屬等中的致病菌將隨著污水外排進入到后續(xù)環(huán)境。加強畜禽養(yǎng)殖行業(yè)監(jiān)管、提高畜禽養(yǎng)殖廢水處理效率以最大程度降低養(yǎng)殖廢水環(huán)境和公共健康威脅刻不容緩。

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