蘋果樹腐爛病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的分離提取與致病性研究

袁艮霞，李思南，秦 辰，王 惠*，黃麗麗*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊陵 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

隨著蘋果種植面積的不斷擴(kuò)大，蘋果樹腐爛病日趨嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重影響到我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。蘋果樹腐爛病俗稱臭皮病、爛皮病、串皮病，是由黑腐皮殼屬真菌(Valsamali)引起的樹枝干皮層腐爛病害[1]，由于對(duì)其致病機(jī)理還不十分清楚，導(dǎo)致對(duì)該病的防治比較盲目。要想搞清楚致病機(jī)理，必須對(duì)其分泌的致病活性物質(zhì)進(jìn)行研究。目前對(duì)蘋果樹腐爛病菌代謝產(chǎn)物的研究主要集中在酶類物質(zhì)、根皮苷的降解產(chǎn)物、異香豆素類物質(zhì)、有機(jī)酸類等[2-10]。也有研究表明，蘋果樹腐爛病菌分泌的蛋白類物質(zhì)有致病活性[11]，但關(guān)于其揮發(fā)性成分目前還尚未見研究報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)蘋果樹腐爛病菌的MS培養(yǎng)濾液中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離提取和結(jié)構(gòu)定性，以蘋果樹枝條為生物測(cè)定材料進(jìn)行致病性檢測(cè)，初步確定蘋果樹腐爛病菌代謝的揮發(fā)性成分與致病的關(guān)系，以期為該病菌致病機(jī)理的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治研究團(tuán)隊(duì)提供，于PDA培養(yǎng)基4℃保存。

MS培養(yǎng)基：取蔗糖5 g，L-天門冬酰胺2 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，七水合硫酸鋅0.88 g，微量元素：水合硝酸鐵1.5 mg，五水合硫酸錳0.44 mg，VH0.005 mg，VB10.1 mg，于1 000 mL水中，每1 000 mL培養(yǎng)基中加100 μL微量元素，pH為5～8。

1.1.2 儀器與試劑 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:QP201V1tra型。乙酸乙酯：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。異戊醇，2-苯乙醇均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)濾液的制備 先將菌株03-8接種至PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)3 d。用直徑5 cm的打孔器沿菌落邊緣打出菌株長(zhǎng)勢(shì)均勻的菌餅接種于MS液體培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照，25℃進(jìn)行培養(yǎng)，每天搖瓶1次，培養(yǎng)20 d。用布氏漏斗抽濾得到培養(yǎng)濾液。

1.2.2 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的收集 取上述培養(yǎng)濾液300 mL于圓底燒瓶中，進(jìn)行普通蒸餾，用10 mL乙酸乙酯收集餾分，收集液封口保存于4℃冷藏箱中。

1.2.3 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的定性分析 取收集液在如下GC-MS條件下進(jìn)行分析測(cè)定，GC-MS條件：石英毛細(xì)管柱(30.0 m×0.25 mm)，升溫程序60～100℃(10℃·min-1)，100～240℃(4℃·min-1，240℃保留3 min)，柱流量1.0 mL·min-1。接口溫度230℃外，進(jìn)樣量2 μL，載氣He進(jìn)樣方式為不分流，柱流量1.11 mL·min-1，吹掃流量3 mL·min-1。EI源，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度220℃，掃描質(zhì)量范圍50～500。通過與譜庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖對(duì)照初步確定收集液中各成分的結(jié)構(gòu)。

1.2.4 純物質(zhì)對(duì)蘋果樹枝條的致病活性測(cè)定方法 枝條的準(zhǔn)備：取粗細(xì)和長(zhǎng)短相等且長(zhǎng)勢(shì)相近的健康蘋果樹枝30支，用0.6%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min進(jìn)行消毒，然后用無菌水漂洗3次，于超凈工作臺(tái)上晾干，用石蠟封在形態(tài)學(xué)上端以防止過多水分散失，用濕潤(rùn)棉花包裹形態(tài)學(xué)下端保濕，保證試驗(yàn)過程中枝條存活。

活性測(cè)定：先用灼燒后的打孔器在每個(gè)枝條中間表面造成傷口，然后分2組處理進(jìn)行試驗(yàn)，第1組用微量注射器在枝條傷口處分別滴異戊醇10 μL和2-苯乙醇10 μL，每個(gè)樣品處理3個(gè)枝條。以未滴加任何物質(zhì)的帶傷枝條為對(duì)照，保存在密封的培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察；第2組在傷口上除滴加相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)后，再將PDA上培養(yǎng)了3 d的蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8菌餅接于傷口處，其余條件保持與第1組一致。置于25℃恒溫室中培養(yǎng)，80 h后進(jìn)行病斑大小測(cè)定。病斑面積大小以長(zhǎng)直徑與短直徑的乘積表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理均經(jīng)過SPSS(16.0)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確定

用GC-MS分別對(duì)空白培養(yǎng)基及培養(yǎng)濾液的收集液進(jìn)行定性分析得到色譜圖(圖1)。圖1培養(yǎng)濾液中的2個(gè)揮發(fā)性組分A和B的對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖分別見圖2(A)和(B)中上圖，在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的與其相似度最高的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖見圖2(A)和(B)中下圖。與譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)比得到的相應(yīng)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖3。由圖3可知，這2種物質(zhì)分別為異戊醇和2-苯乙醇。

圖1 空白培養(yǎng)基及蘋果樹腐爛病菌03-8的MS培養(yǎng)濾液中揮發(fā)性代謝物的色譜圖

注：每組圖中上邊為蘋果樹腐爛病菌03-8的MS培養(yǎng)濾液中揮發(fā)性代謝物的質(zhì)譜圖，下邊為數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度最高的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖；A為異戊醇，B為2-苯乙醇。

圖2蘋果樹腐爛病菌03-8的MS培養(yǎng)濾液中2種揮發(fā)性代謝物的質(zhì)譜圖及譜庫(kù)對(duì)比圖

Fig.2 Comparison of mass spectra of two volatile metabolites in MS culture filtrate ofV.mali03-8 with standard spectra

圖3 蘋果樹腐爛病菌03-8的MS培養(yǎng)濾液中2種揮發(fā)性代謝物的結(jié)構(gòu)

2.2 異戊醇和2-苯乙醇的生物活性

利用蘋果枝條作為生測(cè)對(duì)象，檢測(cè)純異戊醇和2-苯乙醇的生物活性結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，b-ck的病斑大小明顯>a-CK，說明本試驗(yàn)使用的蘋果樹腐爛病菌具有明顯的致病性。從圖4還可以看出，a-CK枝條上沒有顯示病斑，而a-1和a-2枝條上明顯有病斑 ，表明異戊醇和2-苯乙醇均對(duì)蘋果樹枝具有致病活性。另外圖4還顯示，b-1和b-2與b-CK相比，只有b-CK菌絲能夠正常生長(zhǎng)，而滴加異戊醇和2-苯乙醇后再接的菌餅幾乎沒有菌絲生長(zhǎng)的跡象，表明這2種化合物對(duì)03-8的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。

對(duì)圖4中各處理的致病斑面積大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果見表1。對(duì)表1中各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析的結(jié)果見表2。表1和表2表明，a-1和a-2的病斑大小均與a-CK在P=0.05水平上差異顯著，說明異戊醇和2-苯乙醇對(duì)蘋果樹枝條具有明顯的致病活性。

注：a-ck：傷口未處理；a-1：傷口+異戊醇；a-2：傷口+2-苯乙醇；b-ck：傷口+菌餅；b-1：傷口+異戊醇+菌餅；b-2：傷口+2-苯乙醇+菌餅。菌餅：蘋果樹腐爛病菌03-8菌餅。

圖4異戊醇和2-苯乙醇對(duì)蘋果樹枝條的致病活性測(cè)定結(jié)果

Fig.4 Bioactivity on apple tree branches of 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethan-1-ol

從表1和表2可以看出，b-1與b-CK差異顯著，而且b-1的病斑明顯

從表1和表2還可以看出，b-2與b-CK差異不顯著，似乎意味著在菌餅存在時(shí)2-苯乙醇沒有顯示出致病活性；但將a-2和b-2進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，a-2和b-2也無顯著性差異，似乎在2-苯乙醇存在時(shí)菌餅沒有表現(xiàn)出致病活性。綜合分析認(rèn)為是2-苯乙醇的存在抑制了03-8菌餅的致病活性。

表1 蘋果枝條接觸揮發(fā)性代謝物后的病斑面積

注：a-CK：傷口未處理；a-1：傷口+異戊醇；a-2：傷口+2-苯乙醇；b-CK：傷口+菌餅；b-1：傷口+異戊醇+菌餅；b-2：傷口+2-苯乙醇+菌餅。菌餅：蘋果樹腐爛病菌03-8菌餅。

表2 蘋果枝條接觸揮發(fā)性代謝物后的病斑面積的顯著性分析結(jié)果

注：A表示有顯著性差異，B表示無顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 異戊醇和2-苯乙醇是蘋果樹腐爛病菌的代謝產(chǎn)物

本試驗(yàn)從蘋果樹腐爛病菌的發(fā)酵液中分離得到2個(gè)揮發(fā)性化合物：異戊醇和2-苯乙醇，為了確認(rèn)，試驗(yàn)中同時(shí)改變了培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)濾液中也檢測(cè)到這2種揮發(fā)性成分，表明這2種物質(zhì)是蘋果樹腐爛病菌的代謝產(chǎn)物。目前還尚未見到從蘋果樹腐爛病菌甚至從其他果樹病害的病原菌代謝產(chǎn)物中分離到這2種物質(zhì)的報(bào)道，僅有從植物及其他微生物中分離得到這2種物質(zhì)的報(bào)道[12-16]。

3.2 異戊醇和2-苯乙醇是蘋果樹腐爛病菌的致病活性物質(zhì)

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異戊醇和2-苯乙醇對(duì)蘋果樹枝條均有直接的致病活性，表明它們就是蘋果樹腐爛病菌的致病活性物質(zhì)。另外，本試驗(yàn)在進(jìn)行2種揮發(fā)性物質(zhì)的生物活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，在滴加了異戊醇的蘋果樹枝條上接蘋果樹腐爛病菌的菌餅和不接菌餅，產(chǎn)生的病斑大小在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)差異不顯著。在滴加了2-苯乙醇的枝條上同樣接蘋果樹腐爛病菌菌餅，與不接菌餅產(chǎn)生的病斑大小在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)差異也不顯著。表明異戊醇和2-苯乙醇的存在都抑制了蘋果樹腐爛病菌的正常致病性。分析認(rèn)為，這2種物質(zhì)都是蘋果樹腐爛病菌在對(duì)蘋果樹致病過程中產(chǎn)生的致病活性成分，由于致病過程中代謝產(chǎn)生的物質(zhì)量很少，逐漸進(jìn)入樹體對(duì)病原菌本身并無明顯抑制作用，使病原菌可以繼續(xù)代謝進(jìn)一步發(fā)揮致病作用。而本試驗(yàn)直接使用了10 μL純物質(zhì)，其濃度遠(yuǎn)大于病原菌分泌的量，相當(dāng)于在生物合成反應(yīng)體系中突然出現(xiàn)了大量的產(chǎn)物，抑制了正反應(yīng)的進(jìn)行，因此病原菌分泌異戊醇和2-苯乙醇的反應(yīng)受到抑制，也就是病原菌的致病作用受到了抑制。這進(jìn)一步佐證了異戊醇和2-苯乙醇是蘋果樹腐爛病菌的致病活性物質(zhì)這一論點(diǎn)。

這一點(diǎn)在之前的文獻(xiàn)中也尚未見報(bào)道，只有一些關(guān)于異戊醇和2-苯乙醇作為香氣成分的報(bào)道[15-17]。

3.3 異戊醇和2-苯乙醇具有抑菌活性

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在蘋果樹枝條上滴加了異戊醇或2-苯乙醇后再接腐爛病病原菌時(shí)，該菌不但不能致病，而且沒有了生長(zhǎng)的跡象，表明這2種物質(zhì)在10 μL的量上就可以抑制該菌的生長(zhǎng)。關(guān)于苯乙醇的抑菌活性曾有報(bào)道。陳利軍[18]等分析了1株分離自淡竹的產(chǎn)香真菌蒙塔涅梨孢假殼的揮發(fā)物成分，發(fā)現(xiàn)其能夠不同程度地抑制5種植物病原真菌的生長(zhǎng)，其中主要成分為苯乙醇，說明苯乙醇本身具有抑菌作用。

3.4 異戊醇可能是蘋果樹腐爛病菌致病過程中產(chǎn)生的中間體

在進(jìn)行2種揮發(fā)性物質(zhì)的活性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在滴加純異戊醇的枝條上接蘋果樹腐爛病菌菌餅，其病斑比直接接菌餅反而小，分析認(rèn)為可能是本試驗(yàn)使用的異戊醇的濃度過高抑制了蘋果樹腐爛病菌的正常生長(zhǎng)。另外，黃丹[19]等從濃香型大曲中分離得到一株產(chǎn)酯化酶霉菌，鑒定為黃曲霉(Aspergillusflavus)通過GC-MS對(duì)其代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)其中含有異戊醇及2-苯乙醇，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這2種化合物會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酸及酯，其代謝產(chǎn)物的合成大致呈醇-酸-酯的變化規(guī)律。對(duì)從中分離到的細(xì)菌嗜熱葡糖苷酶芽胞桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，異戊醇等各種高級(jí)醇逐漸減少甚至消失，而酯類物質(zhì)則逐漸增加[20]。張靜[21]等通過SPME-GC-MS測(cè)定不同品種牡丹花在3個(gè)開花時(shí)期的揮發(fā)性物質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)花蕾期以醇類為主，盛花期和衰花期酯類物質(zhì)含量均增加。聯(lián)系到蘋果樹腐爛病菌培養(yǎng)后期散發(fā)出特殊的氣味，因此推測(cè)，在含有低濃度異戊醇時(shí)，蘋果樹腐爛病菌能夠利用異戊醇合成其他的代謝產(chǎn)物，而當(dāng)異戊醇濃度達(dá)到一定的限度后就會(huì)抑制相應(yīng)的反應(yīng)。至于這2種揮發(fā)性物質(zhì)在蘋果樹腐爛病菌中的代謝途徑及其在致病機(jī)理中的作用還有待進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證。

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