不同甲酯化方法對(duì)開口箭地上部位脂肪酸分析的影響

柏國(guó)清，路強(qiáng)強(qiáng)，陳智坤，趙 寧，張忠飛，石新衛(wèi)*

(1.陜西省西安植物園，陜西 西安 710061；2.陜西省植物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710061；3.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

開口箭(Campylandrachinensis)又名竹根七，系百合科(Liliaceae)開口箭屬多年生草本植物，主要分布于我國(guó)中部及西南部[1]，陜西太白山及秦嶺以南大部分地區(qū)均有分布[2]。其根莖味甘微苦，性寒，多為民間用藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀鎮(zhèn)痛等功效[3]。化學(xué)成分研究表明，開口箭根莖中主要含有甾體皂苷、黃酮和強(qiáng)心苷類化合物，揮發(fā)油成分主要為烴類、含烴衍生物和甾族等，其脂肪酸主要為正十六烷酸、正十八烷酸、亞油酸、反-油酸等[4-6]，而開口箭地上部位化學(xué)成分的研究并未見文獻(xiàn)報(bào)道。脂肪酸是植物體主要的化學(xué)成分之一，由于其長(zhǎng)碳鏈、高沸點(diǎn)、難揮發(fā)等特性，導(dǎo)致脂肪酸的分離與檢測(cè)困難，故對(duì)其組分進(jìn)行分析時(shí)，需對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化衍生處理[7-8]。本試驗(yàn)采用BF3-CH3OH甲酯化法和HCl-CH3OH甲酯化法對(duì)開口箭地上部位脂肪酸進(jìn)行預(yù)處理，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)測(cè)定和NIST2011譜庫(kù)檢索，旨在比較和評(píng)價(jià)不同甲酯化方法對(duì)開口箭地上部位脂肪酸分析的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材

開口箭地上部位于2016年9月采自陜西秦嶺南坡的牛背梁地區(qū)，海拔1 100 m，經(jīng)陜西省植物研究所周亞福副研究員鑒定。

1.2 儀器與試劑

微型中草藥粉碎機(jī)FW177，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平FB124，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；索氏提取器ZH114555C，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器DF-101S，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB-2100，日本EYELA(東京理化)器械株式會(huì)社；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)7890A-5975C、自動(dòng)進(jìn)樣器7683，美國(guó)安捷倫公司。

BF3-CH3OH(50%，m·V-1)分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鉀、濃鹽酸、無(wú)水乙醚、甲醇、正己烷均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為純凈水。

1.3 方法

1.3.1 開口箭地上部位脂溶性成分提取 開口箭地上部位樣品作陰干處理，粉碎過60目篩，精密稱取2份，每份60.00 g，分別置于索氏提取器中，以無(wú)水乙醚為溶劑，45℃回流提取3 h，45℃減壓蒸餾，回收乙醚[9]，分別得清亮透明淡黃綠色脂肪油，40℃水浴，揮干溶劑。

1.3.2 BF3-CH3OH甲酯化法 取1 mL正己烷完全溶解上述1份脂肪油，加入到含有5 mL 0.5 mol·L-1KOH-CH3OH溶液的25 mL圓底燒瓶中，搖勻后于75℃油浴，回流皂化1 h，冷卻后加入正己烷重復(fù)洗滌[10]；然后用2 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為3.0，最后置于25 mL分液漏斗，用等體積正己烷萃取，40℃減壓蒸餾，回收正己烷，濃縮至約1 mL；加入2 mL BF3-CH3OH(14%，m·V-1)溶液,于80℃油浴,甲酯化30 min，隨后加入2 mL水終止反應(yīng)，并置于25 mL分液漏斗，用正己烷萃取3次，取上層溶液，無(wú)水硫酸鈉干燥處理即得脂肪酸甲酯化物；待溶劑于40℃減壓蒸餾回收后，另取0.5 mL正己烷重新溶解，并過0.45 μm微孔濾膜，備GC-MS分析測(cè)試用[11]。

1.3.3 HCl-CH3OH甲酯化法 取1 mL正己烷完全溶解上述1份脂肪油，加入到含有5 mL 飽和KOH-CH3OH溶液的25 mL圓底燒瓶中，搖勻后于75℃油浴，回流皂化30 min[12]；冷卻后加入5 mL 2 mol·L-1HCl-CH3OH溶液，于80℃油浴，甲酯化10 min；冷卻后，置于25 mL分液漏斗，用正己烷萃取3次，取上層溶液，無(wú)水硫酸鈉干燥處理即得脂肪酸甲酯化物；待溶劑于40℃減壓蒸餾回收后，另取0.5 mL正己烷重新溶解，并過0.45 μm微孔濾膜，備GC-MS分析測(cè)試用[13]。

1.3.4 GC-MS分析測(cè)試條件 色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣(99.999%)，流速：恒流1.0 mL·min-1；程序升溫：柱溫70℃保持5 min，以70℃·min-1升至200℃，以2℃·min-1升至280℃；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比5∶1；進(jìn)樣溫度270℃。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源模式(EI+)，電離能量70 eV；離子源溫度230℃，接口溫度280℃，四級(jí)桿溫度150℃；掃描方式為SCAN全掃描，質(zhì)量掃描范圍為33～500，溶劑延遲3 min；標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)為NIST2011版譜庫(kù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分

按上述試驗(yàn)方法和條件，對(duì)開口箭地上部位的脂溶性成分進(jìn)行提取和甲酯化處理，經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析，并得到GC-MS總離子流色譜圖(TIC)(圖1)。通過NIST2011標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索和85%以上相似度篩選，共確認(rèn)了31種化學(xué)成分，其中包括21種脂肪酸成分。利用峰面積歸一化法并通過7890A-5975C化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，求得各化學(xué)成分的峰面積相對(duì)含量(表1)。

2.2 脂肪酸種類與含量差異

表1分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BF3-CH3OH甲酯化法處理鑒定得到18種脂肪酸成分，主要種類有(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(24.483%)、正十六烷酸(16.693%)、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(14.830%)、正十九烷酸(8.229%)、正十二烷酸(3.257%)等；經(jīng)HCl-CH3OH甲酯化法處理鑒定得到14種脂肪酸成分，主要種類有正十九烷酸(24.824%)、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(16.013%)、正十六烷酸(10.987%)、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(9.263%)、正十七烷酸(1.722%)等。

表1 開口箭地上部位脂溶性成分甲酯化處理情況及相對(duì)含量

圖1 BF3-CH3OH和HCl-CH3OH甲酯化法處理所得GC-MS總離子流色譜

2.3 2種甲酯化方法對(duì)脂肪酸鑒定的影響

經(jīng)BF3-CH3OH和HCl-CH3OH 2種甲酯化方法處理，共鑒定得到21種脂肪酸成分，其中共有成分13種，前種處理方法鑒定的正十二烷酸、正十六烷酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸含量明顯高于后種處理方法鑒定所得，而癸二酸、正十四烷酸、十六烷酸硅、正十七烷酸、正十九烷酸含量明顯低于后者。非共有成分中，前種處理方法鑒定得到阿魏酸、正十三烷酸、油酸、7,10-二烯基十六烷酸、(Z)-9-十六烯酸、L-抗壞血酸-2,6-二十六烷酸，而后種處理方法鑒定得到肉豆蔻油酸、三甲基硅烷基肉豆蔻酸。

3 結(jié)論與討論

脂肪酸甲酯化是將高沸點(diǎn)且難揮發(fā)、氣化的脂肪酸甘油酯和游離脂肪酸先皂化為脂肪酸，再使脂肪酸與甲醇充分反應(yīng)，生成相應(yīng)的脂肪酸甲酯，使其變成低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、氣化的物質(zhì)。KOH-CH3OH溶液的回流皂化是經(jīng)典的皂化方法[15]，0.5 mol·L-1和飽和KOH-CH3OH溶液是2種常用的皂化反應(yīng)濃度，本試驗(yàn)中BF3-CH3OH甲酯化法取5 mL 0.5 mol·L-1KOH-CH3OH溶液回流皂化1 h和HCl-CH3OH甲酯化法取5 mL飽和KOH-CH3OH溶液回流皂化30 min均可實(shí)現(xiàn)1 mL脂肪油樣品的充分皂化反應(yīng)，并不會(huì)對(duì)進(jìn)一步的甲酯化反應(yīng)產(chǎn)生影響。

脂肪酸的甲酯化方法通常包括三氟化硼法、酸處理法和堿處理法。14%的BF3-CH3OH溶液60～100℃回流2～30 min是結(jié)合態(tài)、游離態(tài)脂肪酸常用的甲酯化方法[16]。酸處理法一般采用1%～20%的硫酸-甲醇溶液，60～90℃回流，反應(yīng)時(shí)間不等，其甲酯化的主要是一般游離型和甘油三脂型的脂肪酸，然而反應(yīng)體系中存在硫酸使甲醇脫水生成甲醚的副反應(yīng)，有可能導(dǎo)致甲酯化反應(yīng)的不完全[17]。因此，本試驗(yàn)選用了2 mol·L-1的HCl-CH3OH溶液，于80℃油浴回流10 min。

本研究利用索氏提取器提取開口箭地上部位中脂肪油，采用BF3-CH3OH和HCl-CH3OH 2種甲酯化法將其衍生為低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、易檢測(cè)的脂肪酸甲酯，經(jīng)GC-MS分析和NIST2011譜庫(kù)檢索，共分離鑒定得到化學(xué)成分31種，其中脂肪酸成分21種，共有成分13種，正十三烷酸、肉豆蔻油酸、三甲基硅烷基肉豆蔻酸、(Z,Z)-7,10-十六碳二烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、3,5-二叔丁基-4-羥基苯丙酸、L-抗壞血酸-2,6-二十六烷酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和16-甲基十七碳酸均為首次從開口箭中分離鑒定得到。BF3-CH3OH甲酯化法分離鑒定的化學(xué)成分種類多，脂肪酸成分類型豐富，不飽和脂肪酸含量高，這與其反應(yīng)機(jī)理密切相關(guān)：2 mol·L-1的HCl酸化調(diào)節(jié)可使反應(yīng)溶液始終處于酸性條件，有利于脂肪酸酯的皂化，另外BF3作為酸性催化劑，能夠消耗反應(yīng)體系中存在的水并形成硼酸，有利于促進(jìn)甲酯化反應(yīng)的正向進(jìn)行，且不會(huì)破壞不飽和脂肪酸。HCl-CH3OH甲酯化法雖處理過程簡(jiǎn)便，操作時(shí)間短，試劑用量少，但未開展方法學(xué)中HCl濃度、取用量、酯化溫度和回流時(shí)間的考察，從而有可能造成甲酯化不徹底，導(dǎo)致分離鑒定的脂肪酸類型偏少、含量偏低。

(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(亞油酸)是功能性多不飽和脂肪酸代表物質(zhì)之一，研究表明其具有降低血清膽固醇和血脂的作用，有助于抑制動(dòng)脈血栓的形成，可作為治療動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死等心血管疾病藥物的原料[18]；(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸甲酯可作為表面活性劑原料，供洗滌劑、香料和化妝品用。(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(亞麻酸)又稱維生素F，是構(gòu)成細(xì)胞膜和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是人體內(nèi)必需的不飽和脂肪酸，臨床研究表明其具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化、降低膽固醇、降血脂、維持脂蛋白平衡、抑制血小板聚集和增加胰島素分泌等作用[19]。

綜上所述，經(jīng)BF3-CH3OH甲酯化法處理開口箭地上部位脂溶性成分，有利于進(jìn)一步開發(fā)利用其含有的不飽和脂肪酸。

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