扇貝酶解條件的優(yōu)化及其抗氧化性的研究

梁曉芳，牟建樓，嚴超，王頡

(河北農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

目前，開發(fā)海洋生物資源是各國研究的重要的熱門領(lǐng)域之一。從海洋生物中提取活性成分并將海洋生物制備成功能性食品，是研究開發(fā)的目的[1]。扇貝是營養(yǎng)價值很高的珍貴海產(chǎn)品，是我國沿海地區(qū)的主要養(yǎng)殖物種。扇貝的殼、肉、珍珠層具備極其高的利用價值，很多扇貝都可以被當成美食供人們食用[2]。

近年來，海產(chǎn)蛋白資源的酶解及利用吸引了研究人員濃厚的興趣，可利用的海產(chǎn)資源十分豐富，許多魚類[3]、甲殼素動物[4]、蝦類等[5]都應(yīng)用于酶解。海洋生物蛋白酶解后呈現(xiàn)出溶解性增大、流動性增加、乳化性增強等優(yōu)點[6]。因此，通過酶解海洋生物蛋白制備的產(chǎn)品不僅在食品工業(yè)，而且在醫(yī)藥領(lǐng)域中將會得到廣泛應(yīng)用。我國目前對扇貝的研究利用主要集中在生物酶解、功能研究等方面，劉媛等[7]利用海灣扇貝制備的多肽可以抑制人肝癌HepG2細胞的生長，張莉莉[8]制備出的扇貝蛋白抗氧化肽對線蟲壽命具有顯著的延長效果，張超等[9]用堿性蛋白酶對扇貝裙邊的水解進行了優(yōu)化，李彩等[10]對扇貝裙邊抗氧化肽的制備條件進行了探索與優(yōu)化。

本文旨在對扇貝的酶解條件進行優(yōu)化，并且對制得的酶解液的抗氧化性進行檢測，為后期研發(fā)具有抗氧化活性的扇貝發(fā)酵調(diào)味品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海灣扇貝、蝦夷扇貝：河北農(nóng)業(yè)大學科技市場，冷凍保存。

蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醛(分析純) 天津市福晨化學試劑有限公司；DPPH 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、抗超氧陰離子試劑盒(A052) 南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；79-2單、雙向磁力加熱攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；AR423CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；JJ-2組織勻漿機 金壇市億通電子有限公司；PHS-3C型pH 計 上海虹益儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 扇貝酶解工藝流程

扇貝解凍→去除內(nèi)臟，清洗→切碎→絞成肉糜→稱量→加水勻漿→調(diào)節(jié)pH→加入蛋白酶→保溫酶解→100 ℃滅酶→4500 r/min離心15 min→取上清液→扇貝酶解液。

1.2.2 扇貝品種的選擇

為選出水解度高、DPPH自由基清除率強的扇貝種類，分別稱取海灣扇貝和蝦夷扇貝肉糜各20 g，用4種蛋白酶(酶添加量為1%)在適宜條件下進行水解，分別測定各種酶解液的水解度和DPPH自由基清除率，試驗重復(fù)3次。

1.2.3 蛋白酶種類的選擇

為篩選出酶解扇貝蛋白質(zhì)效率高的酶，分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶4種酶作為備選酶，分別在適宜條件下對扇貝蛋白質(zhì)進行酶解，每個處理稱取扇貝肉糜20 g，各種酶的處理見表1。酶解后測定酶解液的水解度和DPPH自由基清除率。各處理互為對照，試驗重復(fù)3次。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different types of proteases

1.2.4 扇貝酶解的單因素試驗

以水解度和DPPH自由基清除率為指標，在其他因素保持不變的條件下，分別考察加酶量(0.4%，0.7%，1.0%，2.0%，3.0%)、酶解溫度(30，35，40，45，50 ℃)、酶解時間(3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 h)、固液比(1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7)對酶解效果的影響，試驗重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率(Y)為因變量，以酶解時間(X1)、酶解溫度(X2)、加酶量(X3)為自變量，采用響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計17組分析試驗，對中性蛋白酶酶解扇貝的條件進行優(yōu)化，試驗設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 水解度的測定

總氮含量測定：采用GB 5009.5-2010中凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮(AAN)含量測定：采用GB/T 5009.40-2003中甲醛值法；水解度(DH)計算公式：

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定

參照劉媛等[11]的方法，并稍做修改。在潔凈而干燥的具塞試管中先后加入1.5 mL樣品，1.5 mL蒸餾水，1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，然后倒入比色皿中在517 nm下測其吸光值，記為As，空白組則用1.5 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定其吸光值，記為Ax；對照組用1.5 mL蒸餾水代替樣品，測定其吸光值，記為A0，并以等體積的蒸餾水空白調(diào)零，DPPH自由基清除率AOA按下式計算：

1.2.8 羥自由基清除率的測定

參照田倩等[12]的方法，并稍做修改。向具塞試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)1 mL,待測樣品溶液1 mL及0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后加入體積分數(shù)為0.01%的H2O2溶液1 mL搖勻，37 ℃水浴1 h，在536 nm波長下測定吸光度(A樣品)；用去離子水代替樣品溶液測定損傷管吸光度(A損傷)；用去離子水代替樣品溶液和H2O2測定未損傷管吸光度(A未損傷)；參照組為等體積的樣品溶液、磷酸鹽緩沖溶液和去離子水，測定吸光度(A參)；空白組為等體積的去離子水和磷酸鹽緩沖溶液，測定其吸光度(A空)。羥自由基清除率的計算公式：

1.2.9 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力的測定依據(jù)試劑盒說明書。以每1 min每1 mg的組織蛋白，在37 ℃條件下使得反應(yīng)體系的吸光度值每變大0.01時，作為1個總抗氧化能力單位，計算公式：

1.2.10 抗超氧陰離子活力的測定

超氧陰離子自由基清除率測定依據(jù)試劑盒說明書。每1 g組織蛋白在37 ℃條件下，反應(yīng)40 min，所能抑制的超氧陰離子自由基相當于1 g的維生素C，所能抑制的該自由基的數(shù)量變化值，作為1個單位，計算公式：

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝品種的選擇

海灣扇貝和蝦夷扇貝的水解度和DPPH自由基清除率的比較見圖1。

圖1 兩種扇貝的水解度和DPPH自由基清除率比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate of two kinds of scallops

由圖1可知，用中性蛋白酶酶解時海灣扇貝的水解度和DPPH自由基清除率明顯(P<0.05)高于蝦夷扇貝，水解度可達到27.96%，DPPH自由基清除率可達到59.51%。經(jīng)凱氏定氮法測得海灣扇貝蛋白質(zhì)含量為45.6%，蝦夷扇貝蛋白質(zhì)含量為31.06%，海灣扇貝的蛋白質(zhì)含量比蝦夷扇貝高，DPPH自由基清除率高，所以選用海灣扇貝做研究。

2.2 蛋白酶種類的選擇

用不同的酶對扇貝進行酶解，結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶對扇貝酶解效果的影響Fig.2 Effect of different enzymes on the enzymatic hydrolysis of scallop

由圖2可知，在3種不同的酶濃度下用中性蛋白酶1.0%酶解后的水解度達到27.96%，顯著高于用其他酶酶解(P<0.05)。酸性蛋白酶1.0%時的DPPH自由基清除率達到54.65%，中性蛋白酶濃度為1.0%時的DPPH自由基清除率為59.39%，均較高。綜合考慮水解度和DPPH自由基清除率，選用中性蛋白酶進行水解。中性蛋白酶酶解效果較好是因為本實驗所選用的中性蛋白酶內(nèi)肽酶，且水解的特異性較寬[13]，切割位點比較廣[14]。

2.3 扇貝酶解的單因素試驗

2.3.1 加酶量對扇貝酶解效果的影響

圖3 加酶量對扇貝酶解效果的影響Fig.3 Effect of the amount of enzyme on the enzymatic hydrolysis of scallop

由圖3可知，隨著加酶量的增加，扇貝的水解度逐漸增加，而DPPH自由基清除率則先增加后降低，在加酶量為1.0%時達到最大值57.88%，且結(jié)果比較顯著(P<0.05)。這是因為當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，酶促反應(yīng)隨著加酶量的增加而增加。當酶濃度增大到一定濃度時，反應(yīng)體系中底物將會出現(xiàn)不足，酶解效率將不再上升甚至會降低。DPPH自由基清除率的降低還因為過多的酶將蛋白質(zhì)水解為活性多肽后又將多肽水解為更短的肽鏈或氨基酸，所以選擇1.0%作為適宜加酶量。

2.3.2 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對扇貝酶解效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the enzymatic hydrolysis of scallop

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，水解度和DPPH自由基清除率都先升高后降低。但是水解度在45 ℃時達到最高點22.48%，而DPPH自由基清除率在40 ℃達到最高點56.36%，且溫度對DPPH自由基清除率的影響比較顯著(P<0.05)。當溫度升高時，酶促反應(yīng)速率加快，但是扇貝蛋白在溫度高時會變性，而且酶本質(zhì)上是蛋白質(zhì)也會發(fā)生變性，所以最后溫度過高時酶解效果會變差。因為水解度在40 ℃和45 ℃時相差不大(P>0.05)，所以選擇40 ℃作為酶解的適宜溫度。

2.3.3 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響見圖5。

圖5 酶解時間對扇貝酶解效果的影響Fig.5 Effect of time on the enzymatic hydrolysis of scallop

由圖5可知，水解度隨著酶解時間的延長而增加，最后趨于平緩，而DPPH自由基清除率先增加后降低，在酶解4 h時達到最大值70.83%，且結(jié)果比較顯著(P<0.05)。酶在酶解時間內(nèi)逐漸對底物進行酶解，所以水解度會增加。DPPH自由基清除率升高之后的降低是由于酶解的多肽又被酶解成了氨基酸，而且酶解時間過長，底物會逐漸減少，酶活力也會降低，所以選擇4 h作為適宜的酶解時間。

2.3.4 固液比對酶解效果的影響

不同的固液比對酶解效果的影響見圖6。

圖6 固液比對扇貝酶解效果的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the enzymatic hydrolysis of scallop

由圖6可知，隨著固液比的增加，水解度和DPPH自由基清除率都是先增加后降低，在固液比為1∶5時達到最高點，此時水解度為21.94%，DPPH自由基清除率為56.21%。因為最初底物濃度過高，過量的底物集聚在酶分子表面，使酶不能高效地進行酶解；在固液比為1∶5時，底物濃度適中，增加了酶解效率；當液體的量再度增加時，底物濃度和酶的濃度都降低，使酶解效率下降。經(jīng)方差分析，固液比對水解度的影響不顯著(P>0.05)，而對DPPH自由基清除率的影響比較顯著(P<0.05)。綜合考慮，選擇固液比1∶5為適宜條件。

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 試驗分析結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解時間、酶解溫度、加酶量為自變量，以DPPH自由基清除率為因變量，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。利用Design-Expert 8.0.5軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，得擬合二次多項式方程：Y=-104.09236+36.99142X1+6.06664X2+34.65560X3-0.13275X1X2+1.83333X1X3-0.17667X2X3-3.90825X12-0.06498X22-16.11319X32。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

續(xù) 表

對回歸模型進行方差分析，分析結(jié)果見表4。

表4 回歸模型顯著性檢驗結(jié)果Table 4 Significance test for regression model

注：R2=0.9831；RAdj2=0.9614；**表示極顯著；*表示顯著；-表示不顯著。

由表4可知，模型F值為45.23，P<0.0001，說明該模型具有顯著性且總體上模型因素的水平項也顯著。失擬項 P=0.4955>0.05，說明未知因素對試驗干擾很小，模型擬合度較好。統(tǒng)計學計算得出模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9831，說明方程的因變量與自變量間的線性關(guān)系顯著。綜合上述各參數(shù)表明該試驗設(shè)計方法可靠，因素水平區(qū)間設(shè)計合理，因此可以用此回歸模型模擬蛋白酶水解扇貝的DPPH自由基清除率在不同因素水平下響應(yīng)值的變化。根據(jù)回歸模型的分析及檢驗結(jié)果，繪制響應(yīng)面圖(見圖7～圖9)，以確定酶解時間(X1)、酶解溫度(X2)、加酶量(X3)這3個因素的交互作用對DPPH自由基清除率(Y)的影響。

圖7 溫度與時間對DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of temperature and time on the scavenging ratio of DPPH radical

圖8 時間與加酶量對DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of time and enzyme dose on the scavenging ratio of DPPH radical

圖9 加酶量與溫度對DPPH自由基清除率的影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of enzyme dose and temperature on the scavenging ratio of DPPH radical

由圖7～圖9可知，響應(yīng)值隨著酶解時間、酶解溫度、加酶量的增大而呈先增后降的趨勢。該響應(yīng)面能夠直觀地反映出各因素水平對響應(yīng)值的作用和影響。

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果驗證

對響應(yīng)面試驗結(jié)果使用軟件進行最優(yōu)化分析，以DPPH自由基清除率最大為評價指標，由回歸方程得到的DPPH自由基清除率最高的組合為：X1=4.30，X2=40.80，X3=1.10，此時DPPH自由基清除率理論值為82.13%。為驗證預(yù)測模型結(jié)果的可行性，在固液比為1∶5，酶解時間為4 h，酶解溫度為40 ℃，加酶量為1.0%的條件下進行中性蛋白酶酶解扇貝的試驗，重復(fù)試驗3次，測得試驗結(jié)果的DPPH自由基清除率平均值為81.76%，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.45%。由此可知，預(yù)測模型與真實值之間有較好的擬合性，能較準確地反映中性蛋白酶酶解扇貝過程中DPPH自由基清除率的變化。

2.5 抗氧化性的測定結(jié)果

在由響應(yīng)面優(yōu)化得到的結(jié)果下測定扇貝酶解液的抗氧化性：總抗氧化能力為0.1 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為0.37 U/g prot，羥自由基清除率為55.31%。

3 結(jié)論

本研究以水解度和DPPH自由基清除率為指標確定了選擇海灣扇貝，用中性蛋白酶對其進行酶解的酶解效率高。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行了三因素三水平的響應(yīng)面試驗，利用響應(yīng)面的方法優(yōu)化了酶解時間、酶解溫度、加酶量對DPPH自由基清除率的影響。優(yōu)化后的酶解條件為加酶量1.0%，酶解溫度40 ℃，酶解時間4 h。此時測得DPPH自由基清除率為81.76%，與預(yù)測值的相對誤差為0.45%。在優(yōu)化后的條件下測得酶解液的總抗氧化能力為0.11 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為0.37 U/g prot，羥自由基清除率為55.31%。這說明扇貝酶解液具有天然的抗氧化能力，可以在抗氧化食品領(lǐng)域發(fā)揮作用。

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