海棠果酵素產(chǎn)品開發(fā)及其生物活性研究

楊志鵬，王婷，袁峰，阮文婷，劉新利*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇 金湖 211600)

海棠果(CalophylluminophyllumL.)，即海棠樹的果實，原產(chǎn)于我國，現(xiàn)主要分布在華北地區(qū)，其果皮色澤鮮紅奪目，果肉黃白色，鮮食酸甜香脆[1]。海棠果中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、多種維生素、有機(jī)酸等，能夠補(bǔ)充人體所需的營養(yǎng)，增強(qiáng)對疾病的抵抗力，具有生津止渴、健脾開胃、澀腸止痢的功效。酵素是指以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其包含天然營養(yǎng)物質(zhì)、酶、有益微生物及其活性代謝物。針對不同人群，酵素產(chǎn)品的原料配伍及工藝側(cè)重點有所不同，酵素產(chǎn)品一是注重有針對性的營養(yǎng)補(bǔ)充，二是注重有針對性的營養(yǎng)均衡。酵素產(chǎn)品市場火熱，也體現(xiàn)了大眾認(rèn)識到合理飲食對健康的重要性，防病于未然[2]。

海棠果酵素在國內(nèi)外研究少見報道，該酵素以海棠果為主要原料，打漿機(jī)打漿后接入益生菌進(jìn)行發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，得到既富含多種營養(yǎng)成分，又包含活性益生菌及有益代謝產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)酵素產(chǎn)品。因此通過本項目開發(fā)海棠果酵素，并研究其活性物質(zhì)、營養(yǎng)成分及功效評價，對于豐富酵素產(chǎn)品種類及其他酵素產(chǎn)品的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。海棠果酵素采用鼠李糖乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，待發(fā)酵完成后對海棠果酵素中的總糖、氨基酸、多酚、膽固醇去除率以及抗氧化性進(jìn)行了研究，提供了較為詳實的數(shù)據(jù)資料，開發(fā)的海棠果酵素對人體調(diào)節(jié)腸道平衡、清除膽固醇和延緩衰老具有重要作用。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌株

發(fā)酵實驗所用到的鼠李糖乳桿菌217-3為我實驗室保藏菌株[3]。

1.2 設(shè)備

FE20型pH計、RS232-C型分光光度計、5417R型離心機(jī)、DJ1-0.12型打漿機(jī)、LDZX-50KB型滅菌鍋、L-8900型氨基酸分析儀、SHP-150型恒溫培養(yǎng)箱、UB-7型酸度計。

1.3 試劑和材料

1.3.1 乳酸菌培養(yǎng)基(MRS)

1 L配方為蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，乙酸鈉3.12 g，磷酸氫二鈉1.63 g，乙酸鉀2.25 g，吐溫80 1 mL，四水硫酸錳0.25 g；膽固醇培養(yǎng)基；MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基。

1.3.2 氯化鈉溶液

0.85 g NaCl溶解于100 mL雙蒸水中，滅菌后使用。

1.3.3 試劑

苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚試劑等：均為分析純；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)：Sigma 公司；乳清蛋白粉：藍(lán)宇科貿(mào)有限公司。

2 試驗方法

2.1 海棠果酵素的生產(chǎn)流程

選取新鮮海棠果→去核→打漿→果汁過濾→添加C，N源→調(diào)節(jié)pH值→滅菌→接入益生菌→發(fā)酵→檢測pH值→后熟→成分檢測→口感調(diào)節(jié)。

2.2 海棠果酵素發(fā)酵時間的測定

由于乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為24 h左右，所以在海棠果酵素發(fā)酵24 h后，于超凈工作臺中每隔1 h取5 mL海棠果酵素用酸度計測其pH值。因為乳酸菌經(jīng)過發(fā)酵后會產(chǎn)生乳酸，使得酵素pH下降，當(dāng)海棠果酵素中的pH穩(wěn)定后，海棠果酵素即發(fā)酵完成，隨后逐漸進(jìn)入后熟階段。

2.3 海棠果酵素總糖含量的檢測

采用苯酚-硫酸法測定酵素中總糖的含量[4]。

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液置于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試管中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，后快速加入5.0 mL硫酸，靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，490 nm處測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后取酵素樣品，稀釋至適宜濃度，用移液槍吸取適宜體積于試管中，重復(fù)上述操作，測定酵素稀釋液的吸光度。

2.4 海棠果酵素氨基酸含量的檢測

先采用茚三酮粗測氨基酸含量，然后使用氨基酸分析儀進(jìn)樣檢測[5]。

準(zhǔn)確吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL，分別置于25 mL的容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為4.0 mL，然后加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液各1 mL，混合搖勻，于水浴上加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，加水至標(biāo)線(25 mL)，搖勻。靜置15 min后，在570 nm波長下，以空白試劑為參比液測定其余各溶液的吸光度。以氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。后吸取澄清的樣品溶液1～4 mL，置于25 mL的容量瓶或比色管中，重復(fù)上述操作，測其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測出的樣品吸光度，計算出氨基酸含量，稀釋適宜倍數(shù)后用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測。

2.5 海棠果酵素多酚含量的檢測

用移液管分別移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度線，濃度分別為10,20,30,40,50 μg/mL。量取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL于試管內(nèi)，再分別加入5.0 mL的10%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波長下測吸光值[6]。以沒食子酸的微克數(shù)為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。量取1 mL待測液，重復(fù)上述操作，測其吸光度。

2.6 海棠果酵素膽固醇脫除能力的研究

血清中高膽固醇含量被認(rèn)為是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素。國內(nèi)外大量臨床實驗證實，服用乳酸菌及其相關(guān)制品具有減少人體血清膽固醇含量、降低心血管疾病發(fā)病率的功效[7]。通過對實驗室保藏的多種乳酸菌的膽固醇脫除率進(jìn)行比較后，選擇膽固醇脫除率最高的鼠李糖乳桿菌217-3為出發(fā)菌株，同時對開發(fā)的海棠果酵素的膽固醇脫除能力進(jìn)行檢測。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將膽固醇工作液分別配制成不同濃度的膽固醇溶液(30,35,40,45,50,55 mg/L)，于550 nm下測定吸光值并繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照同樣方法測定MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中的初始膽固醇含量。將富含活性鼠李糖乳桿菌的海棠果酵素以10%接種于MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵24 h。測定培養(yǎng)上清液中膽固醇含量, 計算膽固醇去除率。膽固醇去除率按下式計算：

去除率=(初始膽固醇含量-上清液膽固醇含量)/初始膽固醇含量×100%。

2.7 海棠果酵素抗氧化性的研究

海棠果中富含多酚類物質(zhì)和原花青素等黃酮類物質(zhì)，是天然的抗氧化劑，對清除人體內(nèi)自由基、抗衰老等方面具有極大的作用。加之采用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，提高了體內(nèi)抗氧化物質(zhì)活性，從而有效清除人體內(nèi)的自由基。海棠果抗氧化性的研究采用DPPH抗氧化實驗。二苯基苦基苯肼(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，DPPH·)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，當(dāng)樣品中存在自由基清除物質(zhì)時，會與自由基的單電子配對而使其吸收逐漸消褪，用分光光度法通過吸收值的變化可計算出樣品清除自由基的活性，從而評價海棠果酵素的抗氧化活性[8]。

用100 μL一定濃度梯度的樣品加入到試管中，然后向每管中加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，混勻避光37 ℃水浴1 h后在517 nm下測定吸光度值，以乙醇做空白對照，每個樣品均平行測定3次，結(jié)果以SC50值表示。DPPH自由基清除率為50%時所需樣品的濃度為SC50，DPPH自由基清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(As/Ac )]×100%。

式中: Ac為空白對照管的吸光度值；As為樣品測定管的吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵菌種的選擇

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)是一種常見的益生菌，在人體新陳代謝中起著關(guān)鍵作用。該菌屬于乳桿菌(Lactobacillus)屬、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)種，革蘭氏陽性菌，無質(zhì)粒，由于其糖代謝時可代謝單糖而不可代謝乳糖而得名。鼠李糖乳桿菌腸道黏著率高，定植能力強(qiáng)，并具有高效降膽固醇、促進(jìn)細(xì)胞分裂的能力，可起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力及抗癌等重要生理保健功能，可廣泛應(yīng)用于青貯飼料、功能食品和醫(yī)療保健等領(lǐng)域[9]。

3.2 海棠果酵素發(fā)酵時間的確定

自接入益生菌菌株后，每隔4 h對海棠果酵素的pH值和活菌數(shù)進(jìn)行檢測，在56 h內(nèi)海棠果酵素的pH值和活菌數(shù)變化曲線見圖1。

圖1 56 h內(nèi)海棠果酵素pH值和活菌數(shù)變化曲線

由圖1可知，海棠果酵素在前4 h內(nèi)，pH值只是略微下降，這是由于接入的益生菌仍處于延滯期，生長緩慢。進(jìn)入對數(shù)期后，pH值呈快速下降的趨勢，4～24 h，pH值從6.32迅速下降至3.43。這階段pH值的快速下降主要歸結(jié)于鼠李糖乳桿菌的快速增殖需要消耗糖代謝提供的能量，由此生成乳酸速度加快。隨著乳酸的不斷生成，海棠果果汁的緩沖能力不斷增強(qiáng)以及鼠李糖乳桿菌的生長代謝受到抑制，進(jìn)入穩(wěn)定期后pH的變化不再明顯，直至48 h左右，pH值基本不再發(fā)生變化，穩(wěn)定在3.02左右。由活菌數(shù)曲線可以看出，開始發(fā)酵的4 h內(nèi)，酵素中的活菌數(shù)并無明顯變化。4 h之后，鼠李糖乳桿菌進(jìn)入指數(shù)期，活菌數(shù)迅速升高，并于24 h左右趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期，基本符合其pH值的變化。由此判定該海棠果酵素的發(fā)酵時間為48 h。

3.3 海棠果酵素總糖含量的檢測結(jié)果

葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的10倍稀釋樣品在490 nm處的吸光度為0.217，由圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，海棠果酵素的總糖含量為175 mg/L。

3.4 海棠果酵素氨基酸含量的檢測結(jié)果

氨基酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 氨基酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的100倍稀釋樣品在570 nm處的吸光值為0.163，由圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，海棠果酵素的氨基酸含量大致為1.422×103mg/L。在使用氨基酸分析儀檢測后，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得出海棠果酵素中的氨基酸總量為1.83×103mg/L，可以檢測到16種氨基酸，含量最高的為脯氨酸，為0.52×103mg/L，排在前4位的氨基酸分別為脯氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和纈氨酸，酵素中必需氨基酸的含量/氨基酸總含量為0.409，達(dá)到了聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)提出的蛋白質(zhì)中必需氨基酸與總氨基酸的比值應(yīng)在0.40以上的參考蛋白模式[10]。

3.5 海棠果酵素多酚含量的檢測結(jié)果

多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素的20倍稀釋樣品液在765 nm處的吸光度為0.3452，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，該海棠果酵素的多酚含量為5.73×102mg/L。

3.6 海棠果酵素去除膽固醇能力的檢測結(jié)果

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

海棠果酵素膽固醇去除率見表1。

表1 海棠果酵素膽固酵去除率

通過結(jié)果分析得出MRS-STC-CHOL培養(yǎng)基中初始膽固醇含量為200 mg/L，上清液的膽固醇含量的53.3 mg/L，因此海棠果酵素的膽固醇降解率為73.4%。對清除人體內(nèi)膽固醇具有顯著效果。

3.7 海棠果酵素清除自由基能力的檢測結(jié)果

采用DPPH抗氧化實驗計算出海棠果酵素的自由基清除能力，清除率曲線見圖6。

圖6 海棠果酵素清除率曲線

根據(jù)曲線可以得出海棠果酵素的自由基清除率較高，具有較高的抗氧化活性，其SC50值為0.0715。

4 總結(jié)

本文以開發(fā)具有高生物活性的海棠果酵素產(chǎn)品為研究目的，通過優(yōu)選活性益生菌菌株，跟蹤檢測發(fā)酵過程pH值、活菌數(shù)、總糖、氨基酸和多酚含量，確定了海棠果酵素的發(fā)酵時間，并通過海棠果酵素的膽固醇脫除能力，對海棠果酵素的體外益生功能做了評價。該產(chǎn)品具有潛在的調(diào)節(jié)人體內(nèi)腸道平衡，提高機(jī)體抗氧化能力和免疫水平，幫助營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，延緩衰老，促進(jìn)身心健康的功效，酸甜可口，適于多種人群的合理膳食。

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