乳酸菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)抗氧化酶活性的研究

于鑫，呂嘉櫪，余芳

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

近年來，益生菌的研究在全球范圍內(nèi)已經(jīng)形成熱潮，益生作用已經(jīng)被國際公認(rèn)并不斷發(fā)現(xiàn)新的功能。國內(nèi)外研究表明：某些益生菌菌體及其代謝產(chǎn)物具有抗氧化活性[1]，主要表現(xiàn)在產(chǎn)生的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等一些抗氧化酶。超氧化物歧化酶(SOD)是一種以超氧陰離子為底物的金屬酶，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，在抗衰老[2]方面起著重要的作用。過氧化氫酶(CAT)是廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，其功能是催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，防止氧化[3]。

國內(nèi)在乳酸菌產(chǎn)SOD酶和CAT酶方面的研究有報道，其中邢德明等[4-7]研究表明嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中均可以產(chǎn)生SOD酶和CAT酶；沈明華等[8-10]研究了乳酸菌發(fā)酵鮮牛乳產(chǎn)SOD酶活性的變化，其中有的發(fā)酵后SOD酶活性提高，有的變化不大。目前對于發(fā)酵鮮乳產(chǎn)CAT酶活性的研究相對較少，馬森等研究結(jié)果表明發(fā)酵乳中CAT酶活性比鮮乳的低；楊小幸等[11，12]研究了益生菌發(fā)酵果蔬過程中能產(chǎn)生SOD酶。

本實(shí)驗(yàn)選用10株益生菌分別在MRS肉湯培養(yǎng)基、鮮牛乳培養(yǎng)基和蔬菜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，研究它們在發(fā)酵過程中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，為抗氧化功能性食品的研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料與試劑

1.1.1 原材料

荸薺、菊芋、油麥菜、芹菜、萵筍、鮮牛乳：西安華潤萬家超市提供。

1.1.2 菌種

保加利亞乳桿(Lactobacillusbulgaricus, LB)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus, LA)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum, LP)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalisubsp., Bb)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus, LGG)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei, LCP)、糞鏈球菌(Enterococcusfaecalis, EF)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles, ST)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei, LC)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri, LR)：由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室提供。

1.1.3 試劑

葡萄糖(生化試劑)、七水硫酸鎂(分析純) 西安化學(xué)試劑廠；酵母浸粉(生化試劑)、牛肉膏(生化試劑)、蛋白胨(生化試劑) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；硫酸錳(分析純) 西安東升化工有限公司；吐溫-80(分析純) 天津恒昊公司化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀(分析純)、乙酸鈉(分析純) 天津市化學(xué)試劑廠；檸檬酸氫二銨(分析純) 天富精細(xì)化工有限公司；超氧化物歧化酶(SOD酶)試劑盒、過氧化氫酶(CAT酶)試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；JY-502電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；YC-26L醫(yī)用冷藏冰箱 中科美菱低溫科技有限公司；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2600紫外分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 MRS肉湯培養(yǎng)基

牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉5 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3.2 鮮牛乳培養(yǎng)基

鮮牛乳于115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用。

1.3.3 蔬菜汁培養(yǎng)基

將荸薺、菊芋、油麥菜、芹菜和萵筍除去雜物，徹底清洗干凈，采用打漿機(jī)榨汁，過100目篩，備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 10株乳酸菌產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)活性的研究

將已活化好的10株乳酸菌按1%比例接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液離心后，取上清液測SOD酶的活性。

1.4.2 10株乳酸菌產(chǎn)過氧化氫酶(CAT)活性的研究

將10株乳酸菌菌種按1%比例接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，取離心后的上清液測定CAT酶的活性。

1.4.3 10株乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)SOD酶活性的研究

將已活化好的10株乳酸菌接種到滅完菌的鮮牛乳中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至凝乳，發(fā)酵乳離心后取上清液測定SOD酶活力。

1.4.4 10株乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)CAT酶活性的研究

將10株乳酸菌接種到滅完菌的鮮牛乳中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)至凝乳，發(fā)酵乳離心后取上清液測定CAT酶活力。

1.4.5 10株乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)SOD酶活性的研究

將已活化好的10株乳酸菌按1%的接種量接種到復(fù)合蔬菜汁培養(yǎng)基中，以不接菌種的蔬菜汁培養(yǎng)基為空白對照，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液離心后取上清液測定SOD酶的活力。

1.4.6 10株乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)CAT酶活性的研究

將已活化好的10株乳酸菌按1%的接種量接種到蔬菜汁培養(yǎng)基中，以不接菌種的復(fù)合蔬菜汁培養(yǎng)基為空白對照，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液離心后取上清液測定CAT酶的活力。

1.5 測定方法

1.5.1 SOD酶測定方法[13]

采用羥胺法。

1.5.2 CAT酶測定方法[14，15]

采用可見光法。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株乳酸菌產(chǎn)SOD酶能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液測定SOD酶活力，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌發(fā)酵48 h時SOD酶活力變化

由圖1可知，10株乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中均可以產(chǎn)生SOD酶。與空白組相比發(fā)現(xiàn)，LA產(chǎn)生的SOD酶最多，活力可達(dá)到38.45 U/mL，其次是LCP，LC，BL，活力依次為36.24，28.43，26.21 U/mL。

2.2 10株乳酸菌產(chǎn)CAT酶能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液測定CAT酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 乳酸菌發(fā)酵48 h時CAT酶活力變化

由圖2可知，與空白組相比10株乳酸菌均產(chǎn)生CAT酶，其中LA產(chǎn)CAT酶活力最多，活力達(dá)到8.56 U/mL，其次是LCP和BL，活力依次是7.23，5.36 U/mL，其他幾株乳酸菌的CAT酶活力差別不明顯。

2.3 10株乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)SOD酶能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到鮮牛乳培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵至凝乳的發(fā)酵乳離心，取上清液測定SOD酶活力，以菌株為橫坐標(biāo)，SOD酶活力為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，結(jié)果見圖3。

圖3 乳酸菌發(fā)酵乳48 h時SOD酶活力變化

由圖3可知，10株乳酸菌在鮮牛乳培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h均產(chǎn)生SOD酶，其中， LA產(chǎn)SOD酶量最多，活力可達(dá)到50.34 U/mL，與在MRS肉湯培養(yǎng)基中相比SOD酶的活力提高了30%，其次是LCP，BL和LC，活力在47.51～39.45 U/mL之間，其他幾株菌產(chǎn)生的SOD酶相對較少。

2.4 10株乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)CAT酶能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到鮮牛乳培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵至凝乳的發(fā)酵乳離心，取上清液測定CAT酶活力，以菌株為橫坐標(biāo)，CAT酶活力為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，結(jié)果見圖4。

圖4 乳酸菌發(fā)酵乳48 h時CAT酶活力變化

由圖4可知，以不接菌種的培養(yǎng)基為空白組，10株乳酸菌發(fā)酵鮮牛乳時均產(chǎn)生CAT酶，其中LA產(chǎn)CAT酶最多，活力達(dá)到9.89 U/mL，這與在MRS肉湯培養(yǎng)基中相比酶活力提高幅度較小，其次是LCP，BL，活力依次是8.56，6.57 U/mL，其他幾株乳酸菌的CAT酶活力差異不明顯。

2.5 10株乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)SOD酶的能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到蔬菜汁培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液離心，取上清液測定SOD酶活力，以菌株為橫坐標(biāo)，SOD酶活力為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，結(jié)果見圖5。

圖5 乳酸菌發(fā)酵蔬菜48 h時SOD酶變化

由圖5可知，以不接菌種的復(fù)合蔬菜培養(yǎng)基為空白組，10株乳酸菌均產(chǎn)生SOD酶，其中LA產(chǎn)SOD酶量最多，活力可達(dá)到118.56 U/mL，這與在MRS肉湯培養(yǎng)基中相比酶的活力提高了2倍，其次是LCP，BL和LC，活力在115.42～99.58 U/mL之間，其次是LP，LCP，ST，LR，SF和LB，產(chǎn)生的SOD酶相對較少。

2.6 10株乳酸菌發(fā)酵蔬菜產(chǎn)CAT酶的能力

以10株乳酸菌為菌種，接種到復(fù)合蔬菜汁培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液離心，取上清液測定CAT酶活力，以菌株為橫坐標(biāo)，CAT酶活力為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖，結(jié)果見圖6。

圖6 乳酸菌發(fā)酵蔬菜48 h時CAT酶變化

由圖6可知，10株乳酸菌發(fā)酵復(fù)合蔬菜培養(yǎng)基時均產(chǎn)生CAT酶，其中LCP產(chǎn)CAT酶最多，活力達(dá)到41.06 U/mL，這與MRS肉湯培養(yǎng)基相比酶活提高了5倍左右，其次是LA，活力是38.84 U/mL，其次是LC，BL，活力依次是31.27，28.53 U/mL，其他幾株乳酸菌的CAT酶活力與空白組相比差別不大。

3 結(jié)論

10株乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基、鮮牛乳培養(yǎng)基和復(fù)合蔬菜汁培養(yǎng)基中都可以產(chǎn)生SOD酶和CAT酶，在MRS肉湯培養(yǎng)基中SOD酶活力在9.82～38.45 U/mL之間，CAT酶活力在1.25～8.56 U/mL之間；在鮮牛乳培養(yǎng)基中SOD酶活力在14.92～50.34 U/mL之間，CAT酶活力在2.25～9.89 U/mL之間；在蔬菜汁培養(yǎng)基中SOD酶活力在76.20～118.56 U/mL之間，CAT酶活力在11.12～41.06 U/mL之間。其中益生菌在蔬菜汁培養(yǎng)基發(fā)酵過程中產(chǎn)SOD酶和CAT酶的活力相對較高。

[1]張江巍,曹郁生.乳酸菌抗氧化活性的研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè),2005,33(1):34-37.

[2]Huang J Z,Lemire B D.Mutations in the Cl elegans succinate dehydrogenase ironsulfur subunit promote superoxide generation and prematuteaging[J].Mol Biol,2009,387:559-569.

[3]張坤生,田薈琳.過氧化氫酶的功能及研究[J].食品科技,2007,32(1):8-11.

[4]邢德明,李新華,袁慎亮,等.SOD乳酸菌高產(chǎn)菌株篩選鑒定及SOD分離純化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2016,35(2):156-161.

[5]高大威,朱光華,王立欣,等.三種食物中乳酸菌的親緣關(guān)系及抗氧化活性研究[J].燕山大學(xué)學(xué)報,2012,36(1):84-88.

[6]張鳳敏.抗氧化益生乳酸菌的篩選[D].無錫：江南大學(xué),2007.

[7]高晶.鼠李糖乳桿菌抗氧化活性的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[8]沈明華.鮮乳及發(fā)酵乳中SOD和T-AOC的活性變化[J].中國奶牛,2008(2):45-47.

[9]馬森.發(fā)酵乳中SOD、CAT、GSH-Px、GST活性的變化[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2007,30(2):67-68.

[10]曾憲碧,劉清敏.雙歧多益生菌多功能酸奶[P].中國專利：CN101611738A，2009-12-30.

[11]楊小幸.果蔬酵素飲料制備及其抗氧化性能[A].中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第十三屆年會論文摘要集[C].中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會,2016.

[12]李雪,和興萍,陳丹,等.乳酸菌發(fā)酵混合蔬菜的初步研究[J].中國釀造,2016,35(9):176-179.

[13]徐東,趙建,黃漢昌,等.改良的黃嘌呤氧化酶法測定動植物組織中SOD比活力[J].食品科學(xué),2011,32(6):237-241.

[14]劉硯韜,王振偉,張伶俐.過氧化氫酶活性測定的新方法[J].華西藥學(xué)雜志,2013,28(4):403-405.

[15]王華芳,展海軍.過氧化氫酶活性測定方法的研究進(jìn)展[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報,2009(19):7-8.