喘息患兒腸道菌變遷與腸局部免疫及炎癥的相關(guān)性研究

曹向可，錢慶增，王維，王彬，劉海燕

（華北理工大學(xué) 1.生命科學(xué)學(xué)院，2.公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山063210；3.河北省唐山市婦幼保健院 兒科，河北 唐山 063000；4.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，河北 唐山 063000）

喘息是臨床常見病癥，高發(fā)于＜3歲患兒[1-2]。如果不能給予患兒及時(shí)有效的對(duì)癥處理，有可能形成反復(fù)喘息，進(jìn)展為哮喘。流行病學(xué)研究顯示，嬰幼兒期喘息的發(fā)病率一直處于高位，嚴(yán)重影響患兒的健康狀況，及早揭示喘息的發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要[3-4]。本研究探討喘息患兒腸道菌變遷與腸局部免疫及炎癥的相關(guān)性，為患兒的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與資料

1.1　一般資料

選取2013年10月-2016年4月于河北省唐山市婦幼保健院診治的＜3歲喘息患兒178例作為觀察組，均符合《諸福堂實(shí)用兒科學(xué)》中喘息的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。其中，男性102例，女性76例；年齡1～3歲，平均（2.0±0.6）歲；體重8.1～17.3 kg，平均（12.9±3.4）kg。選取同期于河北省唐山市婦幼保健院體檢的健康兒童178例作為對(duì)照組。其中，男性105例，女性73例；年齡1～3歲，平均（2.1±0.5）歲；體重8.0～17.5 kg，平均（13.0±4.2）kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒無(wú)呼吸道及消化道感染史，無(wú)個(gè)人及家庭過敏性疾患，無(wú)其他變態(tài)反應(yīng)性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前使用過糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑治療的患兒，患兒存在免疫功能缺陷、活動(dòng)性肺結(jié)核、先天性氣道疾病等肺部相關(guān)病癥，近期使用過益生菌制劑的患兒。兩組年齡、性別、體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象均取得家屬同意，簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2　方法

腸道菌群[（雙歧桿菌、大腸桿菌、腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量值的比值（以下簡(jiǎn)稱B/E值）]檢測(cè)：將新鮮糞便0.5 g加入到無(wú)菌氯化鈉溶液中，使用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的ATB半自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，菌種包括雙歧桿菌、大腸桿菌，以每克糞便濕重中菌落形成單位數(shù)的對(duì)數(shù)值表示lgCFU/g，然后計(jì)算B/E值。

T淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）檢測(cè)：抽取空腹靜脈血2 ml，加入到肝素抗凝管中，采用ELISA法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海巍樊生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作。

免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）檢測(cè)：抽取空腹靜脈血2 ml，加入到肝素抗凝管中，采用免疫比濁法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作。

炎癥因子（白介素-17、C反應(yīng)蛋白）檢測(cè)：抽取空腹靜脈血2 ml，加入到肝素抗凝管中，采用ELISA法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作。同時(shí)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，記錄白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1檢測(cè)：抽取空腹靜脈血2 ml，加入到肝素抗凝管中，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自于武漢博士德生物工程有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　兩組患兒腸道菌群的檢測(cè)結(jié)果比較

觀察組患兒雙歧桿菌、大腸桿菌及B/E值分別為（6.73±0.94）lgCFU/g、（8.61±0.72）lgCFU/g 及（0.78±0.26）。對(duì)照組患兒雙歧桿菌、大腸桿菌及B/E值分別為（10.28±1.13）lgCFU/g、（7.10±0.65）lgCFU/g及（1.45±0.23）。兩組患兒雙歧桿菌、大腸桿菌及B/E值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.317、5.127和12.674，均P=0.000），觀察組患兒雙歧桿菌、B/E值低于對(duì)照組，而大腸桿菌高于對(duì)照組。

2.2　兩組患兒T淋巴細(xì)胞與免疫球蛋白的檢測(cè)結(jié)果比較

觀察組患兒CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA分別為（23.81±0.57）%、（22.10±0.76）%、（1.08±0.13）及（0.64±0.37）g/L。對(duì)照組患兒CD+、CD+、CD+/484CD8+及 IgA 分別為（32.75±0.83）%、（24.92±1.05）%、（1.31±0.20）及（1.12±0.42）g/L。兩組患兒CD+、4CD8+、CD4+/CD8+及IgA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.739、4.276、5.129 和 10.502，均P=0.000），觀察組患兒CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA低于對(duì)照組。

2.3　兩組患兒炎癥因子與細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果比較

觀察組患兒白介素-17、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1分別為（179.43±21.69）ng/L、（13.72±1.20）mg/L、（10.26±1.57）×109/L 和（73.62±10.34）pg/ml。對(duì)照組患兒白介素-17、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1分別為（103.65±17.81）ng/L、（2.01±0.45）mg/L、（5.13±0.81）×109/L和（112.45±15.73）pg/ml。兩組患兒白介素-17、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.626、8.903、13.541和8.403，均P=0.000）；觀察組患兒白介素-17、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1低于對(duì)照組。

2.4　腸道菌群與各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析

雙歧桿菌與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1呈正相關(guān)（r=0.408、0.380、0.417、0.424和0.509，均P=0.000），與白介素-17、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.331、-0.428和-0.392，均P=0.000）。大腸桿菌與CD+4、CD+8、CD+4/CD+8、IgA及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.327、-0.379、-0.293、-0.305 和 -0.412，均P=0.000），與白介素 -17、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.426、0.382和 0.463，均P=0.000）。

3　討論

＜3歲喘息患兒是特殊群體，由于身體機(jī)能狀況較差，發(fā)育并未完全，更易成為喘息易感者[6-7]。不同于成年人的臨床治療，治療方案較為棘手，一旦處理不佳，就有可能造成病情進(jìn)一步發(fā)展，會(huì)長(zhǎng)期影響患兒的身心發(fā)育。喘息的病機(jī)尚未完全清晰，如何治療便成為了臨床醫(yī)生討論的熱點(diǎn)話題。

諸多研究顯示，喘息患兒體內(nèi)多存在不同程度的腸道菌群失衡[8-9]。機(jī)體內(nèi)腸道含有大量腸道菌，數(shù)量是十分驚人的，可高達(dá)人體細(xì)胞數(shù)量的10倍，這些腸道菌不僅參與了宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，還參與了宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，是宿主腸道和免疫系統(tǒng)發(fā)育的重要刺激物[10-11]。

當(dāng)喘息發(fā)作時(shí)，患兒會(huì)發(fā)生不同程度的缺氧缺血，會(huì)造成腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接，而使得腸黏膜通透性增加，這會(huì)誘使腸道內(nèi)病原腸道菌聚集。其產(chǎn)生的毒素也將在局部釋放，可直接損害腸黏膜，造成腸道細(xì)菌與內(nèi)毒素移位，引起應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境改變，不利于腸道正常菌群定植，造成腸道微生態(tài)失衡。

目前，腸道菌群主要為雙歧桿菌和大腸桿菌，其中雙歧桿菌是1899年由法國(guó)學(xué)者TISSIER從母乳營(yíng)養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種厭氧的革蘭陽(yáng)性桿菌，其分布在胃腸的數(shù)量隨年齡階段的增長(zhǎng)而減少，在母乳喂養(yǎng)兒腸道內(nèi)大量存在，對(duì)嬰幼兒有許多好處，包括營(yíng)養(yǎng)、免疫及抗感染、抗過敏、抗腫瘤及調(diào)整腸道功能等作用，可以預(yù)防腹瀉，減少便秘，能起到預(yù)防和治療各種腸道疾病的效果。而大腸桿菌是寄生在人體大腸里對(duì)人體無(wú)害的一種單細(xì)胞生物，正常情況下，大腸桿菌是無(wú)害的，能競(jìng)爭(zhēng)性抵御致病菌的進(jìn)攻，幫助合成維生素K2，與人體是互利共生的關(guān)系。只有在機(jī)體免疫力降低、腸道長(zhǎng)期缺乏刺激等特殊情況下，大腸桿菌可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等，危及患者健康[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組CD+4、CD+8及CD+4/CD8+低于對(duì)照組，說明喘息患兒的機(jī)體免疫能力降低。CD4細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要免疫細(xì)胞，又稱為免疫系統(tǒng)的輔助手，能指揮身體對(duì)抗腸道菌，能夠直接反映人體免疫功能。CD8是作為協(xié)同受體的T細(xì)胞受體的跨膜糖蛋白，其受體主要表達(dá)在表面的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，但也可以發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞、皮層胸腺細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。

通過分析炎癥因子，觀察組白介素-17、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1低于對(duì)照組，說明喘息患兒的體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。白介素-17是T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素之一，是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，白介素-17可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表達(dá)白介素-6和白介素-8，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)白介素-8，粒細(xì)胞集落刺激因子等。C反應(yīng)蛋白可以激活補(bǔ)體和加強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬而起調(diào)理作用，在機(jī)體的天然免疫過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。白細(xì)胞有抵御和消滅外來病菌的作用，因而認(rèn)為，白細(xì)胞計(jì)數(shù)是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF-β超家族，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能有重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。在機(jī)體內(nèi)，還可發(fā)揮抑制免疫活性細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞表型、抑制淋巴細(xì)胞的分化、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生等作用。

經(jīng)相關(guān)性分析，雙歧桿菌與CD+、CD+、CD+/484CD8+、IgA及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1呈正相關(guān)，與白介素-17、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。大腸桿菌與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1呈負(fù)相關(guān)，與白介素-17、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。因而認(rèn)為，＜3歲喘息患兒腸道炎癥反應(yīng)增加可能與雙歧桿菌及分泌型免疫球蛋白A減少有關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]陳廣道, 陳愛歡. 兒童肺炎支原體感染相關(guān)喘息的研究進(jìn)展[J].中華兒科雜志, 2012, 50(10): 756-759.

[2]金蕊, 邱靈芝, 袁文霄, 等. 反復(fù)喘息患兒外周血血清類黏蛋白1樣蛋白3基因表達(dá)水平的意義[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志,2014, 29(21): 1618-1620.

[3]姚苗苗, 王克明, 許群英, 等. 嬰幼兒喘息的病因及相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J]. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2011, 13(3): 195-198.

[4]徐艷娜, 顧劍華, 李永蓮, 等. 反復(fù)喘息嬰幼兒維生素D3水平及與Th1/Th2細(xì)胞平衡變化的相關(guān)性研究[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2015, 30(4): 264-266.

[5]胡亞美, 江載芳. 諸福堂實(shí)用兒科學(xué)[M]. 7版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002: 1172-1177.

[6]方騫, 梁慶紅, 郝明明, 等. 喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞關(guān)系的研究[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 34(8): 908-911.

[7]范飛, 鮑一笑, 華麗, 等. 嬰幼兒喘息急性期聯(lián)合降階梯治療方案中氯雷他定的作用[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2013, 28(4):274-277.

[8]韓紅. 喘息急性發(fā)作期兒童腸道菌群變化與免疫耐受關(guān)系研究[D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2010.

[9]溫玲. 喘息急性發(fā)作期兒童腸道微生態(tài)學(xué)變化及Th9細(xì)胞作用機(jī)制的研究[D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2012.

[10]YUAN M, SHI D Z, WANG T Y, et al. Transformation of trollioside and isoquercetin by human intestinal flora in vitro[J].Chin J Nat Med, 2016, 14(3): 220-226.

[11]YANG X W, WANG N, LI W, et al. Biotransformation of 4,5-O-dicaffeoylquinic acid methyl ester by human intestinal flora and evaluation on their inhibition of NO production and antioxidant activity of the products[J]. Food Chem Toxicol, 2013,55(1): 297-303.

[12]郝明明, 張琳, 方騫, 等. 喘息樣支氣管炎患兒腸道微生態(tài)變化與免疫耐受關(guān)系的研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 25(3):303-305.

[13]吳惠強(qiáng), 陳惠敏. 探析肺炎支原體感染合并喘息患兒的細(xì)胞及體液免疫功能的變化[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2015, 23(4): 45-46.

[14]BIANCHERI P, GIUFFRIDA P, DOCENA G H, et al. The role of transforming growth factor (TGF) -β in modulating the immune response andfibrogenesis in the gut[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2014, 25(1): 45-55.

[15]LOUBAKI L, CHABOT D, BAZIN R. Involvement of the TNF-α/TGF-β/IDO axis in IVIg-induced immune tolerance[J]. Cytokine,2015, 71(2): 181-187.