補陽還五湯對中性粒細胞胞外誘補網(wǎng)形成的血栓溶解作用研究進展

程旭希，孫 瑜，董倩楠，董鑫鑫，祁嘉瑩

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300100)

腦血管疾病尤其是腦缺血是威脅老年人健康的主要疾病，每年約有數(shù)百萬人死于心腦血管缺血類疾病。而補陽還五湯則是廣泛被應(yīng)用于治療或預(yù)防腦缺血類疾病的一方藥劑。補陽還五湯出自清代大醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》[1]，此方中重用黃芪補氣，輔用當歸尾活血，使活血補氣為本，通絡(luò)疏瘀為標，標本兼顧?，F(xiàn)代藥理學也發(fā)現(xiàn)，此方可以改善血液流變動力學，具有抑制血小板聚集、保護內(nèi)皮細胞、抑制凝血酶和相關(guān)蛋白的形成、抑制內(nèi)皮因子的表達等作用。故臨床多用此方治療氣虛血癖類疾病，如腦缺血、腦梗死、足、下肢深靜脈血栓等，均取得很好療效[2]。而其保護腦缺血機制的作用研究也成為近年來研究熱點。

中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)與促進腦缺血疾病發(fā)生呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。NETs是中性粒細胞活化時釋放一種網(wǎng)狀物質(zhì)，具有細胞毒性和血栓形成的效應(yīng)，參與多種疾病的病理過程[3]。本文就近四年來NETs介導(dǎo)的血栓形成機制與補陽還五湯的溶栓機制做一綜述，旨在提出未來研究腦缺血疾病用藥的新思路，為補陽還五湯治療腦缺血再灌注損傷的后續(xù)研究提供相關(guān)理論支持。

1 NETs的概述

1.1NETs的介紹 中性粒細胞是肌體抵御病原微生物入侵的第一道防線，其吞噬入侵的細菌形成吞噬體。中性粒細胞除了具有傳統(tǒng)的吞噬殺菌作用外，NETs是一種新的胞外殺菌形式[4]。NETs主要由DNA、組蛋白與細胞質(zhì)內(nèi)顆粒(源性)蛋白質(zhì)構(gòu)成[5]。其具有黏性，可以準確定位感染部位，這個性質(zhì)對細菌、真菌和寄生蟲等具有捕殺作用。屬于一種重要的先天免疫應(yīng)答機制。從基因?qū)用嫔峡?，NETs中DNA是完整的，細菌等病原微生物被其束縛可無法在體內(nèi)擴散。部分具有病菌分泌細胞外脫氧核糖核酸酶降解NETs，增加了致病毒力[6]。NETs還可以通過激活凝血途徑，形成血凝塊來減少病原體的擴散，然而其生成過多會引發(fā)多器官血栓形成，導(dǎo)致肌體重要臟器缺血，如不及時治療將危及生命[7]。

1.2疾病對NETs的影響 血栓形成是惡性腫瘤的常見并發(fā)癥之一，血栓性疾病已成為癌癥患者致死的重要原因。據(jù)統(tǒng)計約10%～30%的惡性腫瘤在其發(fā)病過程中合并血栓發(fā)生。腫瘤細胞可直接損傷血管壁內(nèi)皮細胞或者通過自身釋放促凝物質(zhì)皆可誘發(fā)血栓形成。但最近研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞也在惡性腫瘤相關(guān)血栓中發(fā)揮至關(guān)重要作用。在對合并靜脈血栓栓塞癥的多種惡性腫瘤患者(如肺腫瘤、肝腫瘤、大腸腫瘤、胃腫瘤)進行研究中，顯示其外周血中性粒細胞計數(shù)明顯高于未合并血栓的惡性腫瘤患者。Demers等[8]將荷瘤小鼠分成兩組，一組加入Dnase，另一組作為陰性對照，然后觀察兩組小鼠血栓形成情況，結(jié)果顯示加入Dnase組血栓形成的量明顯少于對照組，這表明NETs與癌癥相關(guān)血栓的形成有關(guān)系。

Megens等[9]證實，大鼠和人體動脈粥硬化斑塊中有組蛋白生成。Borissoff等[10]發(fā)現(xiàn)，282個重度冠狀動脈粥樣硬化患者通過計算機層析冠狀動脈成像技術(shù)證實其體內(nèi)有大量的胞外dsDNA、核小體及MPO-DNA復(fù)合物存在，同時也證明重度粥樣化患者循環(huán)中凝血酶的水平明顯增加，并證實其血液中NETs含量和冠狀動脈粥樣化程度明顯相關(guān)。Mangold等[11]發(fā)現(xiàn)，ST段抬高型急性冠脈綜合癥患者血管內(nèi)DNA、組蛋白及MPO含量明顯增多，且含量與梗死范圍的大小成正相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)多形核白細胞被高度激活，同時與血小板形成復(fù)合物，此外也發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)DNA酶活性與梗死范圍大小成負相關(guān)。Stakos等[12]發(fā)現(xiàn)，急性ST段抬高型心肌梗死患者血管斑塊破裂處凝血酶活化的血小板和多形核白細胞間的相互作用會導(dǎo)致局部NETs生成，血管內(nèi)組織因子的表達是通過NETs實現(xiàn)的。

NETs的形成使中性粒細胞染色質(zhì)向免疫細胞暴露，因此免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對中性粒細胞自身核酸的抗體，進而參與自身免疫性疾病的病理過程。尹曉雪等[13]引證ANCA可以活化腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)預(yù)刺激的中性粒細胞，致中性粒細胞產(chǎn)生NETs。ANCA作用于中性粒細胞表面的靶抗原蛋白酶3(proteinase,PR3)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)，可導(dǎo)致顯微鏡下多脈管炎及韋格納肉芽腫發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，NETs中存在PR3和MPO,其是ANCA的特異性靶抗原，這使免疫系統(tǒng)進入一個惡性循環(huán)，進而加重小血管炎患者病情。小血管炎患者產(chǎn)生的NETs可將中性粒細胞靶抗原呈遞給樹突狀細胞，進而參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。與NETs形成需要活性氧產(chǎn)生的理論相一致，ANCA與中性粒細胞表面靶抗原結(jié)合，活化中性粒細胞的過程依賴中性粒細胞內(nèi)呼吸鏈的活性氧釋放，同時也為研究ANCA刺激中性粒細胞產(chǎn)生NETs奠定了理論基礎(chǔ)。

1.3對NETs有影響的藥物研究現(xiàn)狀 目前對NETs形成機制研究較為全面，因此也衍生出了許多臨床上藥物研究對應(yīng)的靶點。例如針對組蛋白-DNA復(fù)合物這個靶點，就有采用DNase即DNA降解酶處理的方法，實驗結(jié)果顯示此方法可有效減少后肢缺血再灌注小鼠的后肢肌肉纖維、血管、微血管內(nèi)的NETs水平。再例如針對NETs形成過程中的酶類、激活氧化應(yīng)激活性的信號酶與血小板活性抑制等，都可作為抑制NETs形成的潛在靶點[14]。

NETs對于惡性腫瘤的影響目前有研究表明，喜樹堿可通過減少NE及MMP9蛋白的表達來發(fā)揮減少中性粒細胞進入腫瘤部位及參與腫瘤增殖作用[15]。喬艷婷等[16]通過使用PMA刺激PMN的方法提取NETs，使用DNase和肝素分別處理體外誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細胞，兩組都出現(xiàn)內(nèi)皮細胞活性降低被抑制的情況，但是肝素處理組抑制現(xiàn)象更明顯。此研究表明，肝素能減輕由NETs導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞損傷。

不僅西藥中具有某些活性成分可以作用于這些靶點，中藥中可能同樣具有減少NETs形成或加快NETs降解的某些活性成分。雖然目前有很多對于中藥直接治療缺血再灌注的研究，但中藥直接對NETs作用的研究卻很少。張慶光等[14]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，番櫻桃屬中的酚類化合物可有效抑制NETs的形成，減輕炎癥反應(yīng)。還有研究表明雷公藤的主要活性成分之一雷公藤紅素可有效地抑制NETs的形成和嗜中性粒細胞的氧釋放，其主要機制是下調(diào)SYK-MEK-ERK-NF-KB級聯(lián)信號。也有研究表明唇形科植物丹參內(nèi)的二萜醌類化合物丹參酮ⅡA可顯著抑制嗜中性粒細胞向類風濕炎癥部位的聚集，減少MPO、NE的釋放，并抑制NETs的形成。通過減弱嗜中性粒細胞的凋亡，減少炎癥過程的延長與NETs的形成。可以推測，部分抗血栓形成的中藥及其復(fù)方的作用機制可能包含對嗜中性粒細胞的調(diào)節(jié)作用，減少NETs形成或加快降解，發(fā)揮抗血栓形成的藥效。

2 NETs與血栓形成

在目前血栓形成的研究中，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成的相關(guān)機制對血栓形成的影響，越來越多的被人們所關(guān)注，總結(jié)出NETs與血栓形成之間的關(guān)系。

2.1刺激血小板的聚集 目前普遍認為NETs是一種大分子復(fù)合物，在血栓形成的過程中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，引起血小板激活、黏附、聚集，作用類似νWf因子和纖維蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。徐久元等[17]引證Fuchs進行的體外實驗，用懸浮血漿的血小板灌注NETs，用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)血小板形成許多絲足，并牢固吸附于NETs，這表明吸附于NETs的血小板是活化的。后用全血灌注NETs，第1 min可見少許血小板積聚于NETs，后血小板黏附聚集NETs的纖維結(jié)構(gòu)，過程達9 min以上。在第10 min后用DNA酶處理，會發(fā)現(xiàn)NETs和血小板的聚集被去除；如果在灌注前就在血液中放入DNA酶，則NETs會迅速降解，血小板也不會發(fā)生聚集。此實驗表明，血小板確實是吸附于NETs的纖維結(jié)構(gòu)之上。

2.2激活內(nèi)皮細胞啟動凝血 中性粒細胞在內(nèi)皮損傷的部位聚集和激活被認為是血栓形成的誘因。NETs會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，據(jù)解梓琛等[18]研究發(fā)現(xiàn)，二精致苯基碘(DPI)會明顯抑制這種損傷作用，可以間接說明內(nèi)皮細胞的損傷會導(dǎo)致血栓的形成。

Gupta等[19]將活化的內(nèi)皮細胞和中性粒細胞共同培養(yǎng)3 h發(fā)現(xiàn)，活化的內(nèi)皮細胞可以釋放白介素-8以誘導(dǎo)NETs的形成。且NETs相關(guān)蛋白酶或陽離子蛋白，如防御素和組蛋白，也誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，NETs中的基質(zhì)金屬蛋白酶-9通過活化內(nèi)皮細胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷，從而促進血栓形成[32]。

2.3增強凝血酶及凝血酶依賴的纖維蛋白生成 NETs可通過血小板依賴性途徑和非依賴途徑增強凝血酶的生成，進而促進血液凝固。NETs中的組蛋白H3、H4可直接激活血小板，增加血小板的黏附、聚集，易形成血栓[20]。NETs又可促進凝血酶依賴性的纖維蛋白生成，也可結(jié)合到vWF、纖連蛋白及纖維蛋白原上，加速血液凝固。NETs中的組蛋白可以促進凝血酶的生成，使得可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，加快血液凝固。

2.4促進組織因子的生成 NETs在形成過程中可產(chǎn)生并釋放出組織因子，而組織因子可以激活凝血級聯(lián)反應(yīng)。此外，NETs中含有的NE成分能夠降低組織因子通路抑制劑(TFPI)的活性，這進一步加強了組織因子促凝的作用。因此，組織因子亦可能是NETs促進血栓形成的可能機制之一[21]。

研究還發(fā)現(xiàn)，TF與高親和力的Ⅶ因子(factorⅦ,FⅦ)相結(jié)合,形成TF/FⅦa的復(fù)合物,并促使無活性的FⅦ變成有活性的FⅦa。除此之外,TF還可增加FⅦa和TF/FⅦa的蛋白水解酶和淀粉酶活性,使Ⅹ因子(Fx)轉(zhuǎn)變?yōu)镕Ⅹa,進而使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白,完成外源性途徑的凝血過程[22]。

3 補陽還五湯的溶解血栓的作用

3.1抑制血小板的聚集作用 血栓的形成是一個逐漸進展的過程，當肌體血小板活化后，其膜表面蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，血漿中相應(yīng)受體與之結(jié)合，促進血小板聚集，加速血栓的形成。李振華[23]研究表明，補陽還五湯是通過調(diào)節(jié)血清血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的比例，來抑制血小板的聚集，減緩血栓的形成。將75只健康SD雄性大鼠隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組、西藥組和中藥組各15只，對照組、假手術(shù)組大鼠、模型組大鼠給予生理鹽水灌胃;西藥組大鼠給予氯吡格雷灌胃(7．0 mg/kg);中藥組大鼠給予補陽還五湯灌胃(20 g/kg)。所有大鼠連續(xù)喂養(yǎng)14 d，第15日建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型;測定各組大鼠TXB2和6 keto-PGF1α水平、凝血指標、血小板聚集率、血小板聚集抑制率以及血栓形成時間。結(jié)果:正常組與假手術(shù)組大鼠各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05);與對照組和假手術(shù)組比較，模型組血清TXB2升高、6-keto-PGF1α降低，補陽還五湯組抑制了血小板的聚集，減緩血栓的形成。

3.2保護血管內(nèi)皮細胞功能 補陽還五湯組方中的黃芪能夠不同程度地促進血管內(nèi)皮細胞游走與增生，提高內(nèi)皮細胞表面整合素活性，具有較好的促進血管生成和刺激NO生成作用，降低區(qū)域血管阻力，保護內(nèi)皮細胞，改善微循環(huán);而組方中其他單味藥也通過對內(nèi)皮細胞受損后所表達的促栓因子(如TXAz,ET等)的影響，保護內(nèi)皮細胞的功能[24]。

對補陽還五湯進行拆方研究，發(fā)現(xiàn)補氣藥及活血藥均可減輕血管損傷程度抑制血漿PAI活性。活血藥可顯著降低血漿ET含量;補氣藥可顯著提高血漿t-PA活性，血漿t-PA及其抑制物PAI是反映體內(nèi)纖溶性的重要指標,在血栓形成后,其含量有明顯的變化,表現(xiàn)為t-PA活性下降及PAI活性的增高,模型組動物已表現(xiàn)出這種變化。補陽還五湯顯著地提高了血漿t-PA的活性并降低了PAI的活性,其中補氣藥對t-PA、PAI均有影響,而活血藥對t-PA未顯示影響,卻較明顯地降低PAI的活性[25]。

3.3抑制凝血酶和相關(guān)蛋白的形成 蛋白C系統(tǒng)由凝血酶調(diào)節(jié)蛋白、蛋白C(PC)和蛋白S(PS)組成,具有較強的抗凝活性,約占全血抗凝活性的20%～30%。蛋白C是一種維生素K依賴蛋白,平時以無活性酶原形式存在于血漿中,被激活后通過滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa及促進纖維蛋白溶解而發(fā)揮抗凝抗栓作用。在一些血栓病患者，如DIC、腦梗塞,可見到PC活性降低,這可能是在血栓形成時PC消耗過多所致。唐映紅等[26]研究結(jié)果表明,模型組血漿PC活性有所降低,表明本模型由于凝血系統(tǒng)激活,導(dǎo)致消耗一定的PC,從而使血中剩余的PC有所降低。低分子肝素可使PC活性顯著升高,可能是低分子肝素通過激活A(yù)T-Ⅲ途徑滅活凝血因子,從而使PC消耗減少所致。補陽還五湯組PC活性也高于假手術(shù)組,呈現(xiàn)出與低分子肝素類似的作用,其機制可能與肝素類似。生物堿組既可使AT-Ⅲ活性降低,又可使PC活性降低,推測生物堿中某些成分既具有類似肝素的作用,又可促進PC對凝血因子的滅活,使血中PC消耗增加。噻氯匹啶對PC活性無顯著影響,提示其作用與抗凝系統(tǒng)無關(guān)。而苷對AT-Ⅲ活性無影響,但可使血漿PC活性升高,推測苷可能對凝血因子發(fā)揮直接的抑制作用,或通過其他途徑促進了凝血因子的滅活,使血中PC消耗減少。所以補陽還五湯可以抑制血栓形成。

3.4抑制內(nèi)皮因子的表達 在動脈栓塞類疾病中，血管內(nèi)皮細胞受損大多是作為血栓形成的基礎(chǔ)的。血管內(nèi)皮細胞會合成及分泌一些抗凝抗栓物質(zhì)[27]，并且還會表達TF來參與到凝血與形成血栓的過程中。歐明娥等[28]通過對血管內(nèi)皮細胞研究得出以下結(jié)論。TF是通過作為因子Ⅶ(Ⅶa)的輔因子啟動外源性凝血過程進而發(fā)揮作用的。TFPI是一種Kunitz絲氨酸蛋白水解酶抑制劑,通過結(jié)合并滅活Ⅹa因子,及與TF-FⅦa復(fù)合物結(jié)合Ⅹa因子形成TF-FⅦa-FⅩa-T FPI復(fù)合物來抑制凝血酶和纖維蛋白的產(chǎn)生。該實驗結(jié)果表明，生物堿(1、2 mg/ml)、苷三個劑量、原方三個劑量TF表達均低于凝血酶組。凝血酶刺激后,TF、TFPI m RNA表達均增強,提示凝血酶刺激VEC后,可使VEC產(chǎn)生反應(yīng)性變化,TF和TFPI表達增強。表明補陽還五湯及生物堿、苷對凝血酶誘導(dǎo)的TF表達具有抑制作用,可在轉(zhuǎn)錄水平抑制TF表達,從而抑制凝血酶導(dǎo)致的VEC促凝活性增強。而由于在轉(zhuǎn)錄過程中被抑制，則導(dǎo)致了VEC的促凝作用被抑制，自然地產(chǎn)生了抗血栓的效果。

4 治療現(xiàn)狀

焦玉馮[29]臨床觀察中，選取中風偏癱患者中的40例患者進行常規(guī)康復(fù)訓練治療為參照組，10例患者在康復(fù)訓練的同時加以補陽還五湯展開醫(yī)治為研究組。治療后，研究組患者的上下肢運動評分升高程度優(yōu)于參照組，臨床療效也明顯高于參照組。

周婧[30]對接受治療的共76例腦卒中后急性期肩手綜合征患者隨機分為研究組與對照組各38例。兩組均行康復(fù)訓練治療，研究組加用加味補陽還五湯治療。兩組治療后肩手部腫脹積分、疼痛評分、上肢運動功能均顯著優(yōu)于治療前(P<0.05)，且研究組優(yōu)于對照組(P<0.05)，說明加味補陽還五湯結(jié)合康復(fù)訓練可明顯改善腦卒中后急性期肩手綜合征，并且療效顯著。

李亞等[31]選取腦梗死患者50例，運用隨機雙盲法分為兩組，對照組25例、觀察組25例，對照組給予常規(guī)康復(fù)治療，觀察組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合中藥加味補陽還五湯，比較兩種方案對腦梗死患者恢復(fù)過程的價值。治療前觀察組25例患者NIHSS評分與對照組對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后觀察組NIHSS評分顯然高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療前兩組數(shù)據(jù)對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)治療觀察組改良MAS評分明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組治療前生活能力評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；觀察組治療后ADL Barthel指數(shù)評分明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此結(jié)果表明對腦梗死患者運用中藥加味補陽還五湯方聯(lián)合康復(fù)治療，對患者的肌肉張力有明顯改善，并且可以提高患者生活質(zhì)量，非常適合用于臨床治療。

血管栓塞類疾病是目前高發(fā)的疾病，由文獻和補陽還五湯的溶栓機制與NETs促進血栓形成的機制有著很大的契合度。不難推測，補陽還五湯很有可能是通過調(diào)整或緩解這些血栓形成的機制來溶解血栓的。例如，對于凝血的激活，致使局部血管閉塞，導(dǎo)致凝血異常，從而引起血栓的形成，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)是根本原因。而補陽還五湯可從多方面抑制凝血的發(fā)生，進而抑制血栓的形成和使已形成的血栓溶解。故可以得出結(jié)論：補陽還五湯對中性粒細胞胞外誘補網(wǎng)形成的血栓溶解具有一定作用。而此結(jié)論可以對臨床上血管栓塞類疾病的治療具有積極的指導(dǎo)意義。