細(xì)胞外基質(zhì)在周圍神經(jīng)修復(fù)組織工程學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

蔣銳 於子衛(wèi)

1 昆山市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科(昆山 215300)； 2 上海市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

周圍神經(jīng)損傷可以導(dǎo)致毀滅性的功能殘疾，影響生活質(zhì)量, 在美國每年造成成千上萬人嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。周圍神經(jīng)損傷多數(shù)由外傷或者手術(shù)引起，修復(fù)和重建周圍神經(jīng)缺損一直是世界性的難題，一般來說,大部分周圍神經(jīng)損傷超過3厘米就將導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)不良。以往神經(jīng)自體移植術(shù)被認(rèn)為是外周神經(jīng)修復(fù)的"金標(biāo)準(zhǔn)",但是應(yīng)用顯微外科技術(shù)修復(fù)的神經(jīng)無論是采用外膜還是束膜縫合, 總會(huì)有部分神經(jīng)束錯(cuò)位而失去功能[2]。通過自體神經(jīng)移植修復(fù)周圍神經(jīng)獲得臨床功能恢復(fù)的患者大概只有80%左右[3]，而且存在供區(qū)神經(jīng)功能損害, 可供神經(jīng)長(zhǎng)度和直徑有限是其不可克服的缺陷，因此，尋找自體神經(jīng)的替代品來橋接神經(jīng)缺損,成為研究熱點(diǎn)。研究證實(shí), 雪旺細(xì)胞和束膜結(jié)構(gòu)在神經(jīng)再生中起重要作用,但也是免疫原性的主要攜帶者，而為了去除其免疫原性，同種異體神經(jīng)移植物經(jīng)過放射線照射、低壓凍干、熱或冷的器官保存液等預(yù)處理使其中的雪旺細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致引導(dǎo)神經(jīng)再生的能力大大下降[4, 5]。如何橋接神經(jīng)斷端并引導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)錐向前生長(zhǎng)成了外周神經(jīng)損傷修復(fù)的難點(diǎn)，因此組織工程方法修復(fù)神經(jīng)缺損逐漸成為焦點(diǎn)，而其中的重點(diǎn)問題包括：導(dǎo)管材料的選擇以及神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境。

周圍神經(jīng)之所以不同于中樞神經(jīng)，受損后可以表現(xiàn)為再生性，主要是由于它具有再生的微環(huán)境, 即：雪旺細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)所含的基質(zhì)膜。周圍神經(jīng)損傷后，如果不能重建適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境來引導(dǎo)神經(jīng)突特定地生長(zhǎng)神經(jīng)束，會(huì)導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元生存不足，從而導(dǎo)致疤痕形成和不良的臨床結(jié)果[6,7]。周圍神經(jīng)損傷能否成功修復(fù)，主要取決于是否有適合其生長(zhǎng)的微環(huán)境[8]。組織工程的基本原理和方法是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并且可以被機(jī)體吸收的生物材料上形成復(fù)合物，將細(xì)胞生物材料復(fù)合物植入機(jī)體組織，支架保護(hù)和指引軸突生長(zhǎng)，支架中添加的成分為神經(jīng)重建構(gòu)建一個(gè)良好的微環(huán)境[9]。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是組織中除細(xì)胞以外的所有成分，以往認(rèn)為僅具有連接和支持細(xì)胞的作用，現(xiàn)在指自然發(fā)生沉積在細(xì)胞周圍的大分子物質(zhì)，其為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐和黏附位點(diǎn)，并在細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化和基因表達(dá)中起重要的信號(hào)傳遞作用[10]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，ECM主要存在于在神經(jīng)內(nèi)膜和基底層，排列在軸索雪旺細(xì)胞(schwann cell,SC)單元周圍，主要由層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白I和IV組成[8, 11]。受到創(chuàng)傷后，ECM由入侵的成纖維細(xì)胞和分化的雪旺細(xì)胞分泌，從而形成膠原纖維和橋接神經(jīng)斷端的基膜管;隨后,新生的軸突沿著新的ECM支架生長(zhǎng)[12]。在外周神經(jīng)系統(tǒng)，ECM分子沉積在細(xì)胞周圍組成了雪旺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，以維持組織的結(jié)構(gòu)完整性，為細(xì)胞的黏附、遷移提供合適的微環(huán)境[13];有報(bào)道指出，天然去細(xì)胞的ECM由于它自身天然的聚集性可以模擬組織特應(yīng)的微環(huán)境[14]。純化的ECM蛋白質(zhì),比如膠原蛋白和纖維蛋白等，由于他們能夠支持軸突分枝直到神經(jīng)完全修復(fù)，已經(jīng)被廣泛報(bào)道用于外周神經(jīng)修復(fù)[15, 16]。 現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證明雪旺細(xì)胞來源的ECM扮演著外周神經(jīng)組織導(dǎo)體的角色，能夠增強(qiáng)黏附作用、細(xì)胞生長(zhǎng)和SC的分化，并且調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)[17],因此將有可能利用ECM蛋白來促進(jìn)和指導(dǎo)體內(nèi)的神經(jīng)再生過程。

本綜述主要圍繞周圍神經(jīng)來源ECM的幾個(gè)主要成分，闡述其在構(gòu)建組織工程神經(jīng)中的作用。

1 膠原

膠原是由三條完全一樣的三螺旋α鏈組成的三聚物的超家族，這條三螺旋α鏈決定了組織的結(jié)構(gòu)[6,18],它是ECM中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，并且是ECM中存在最豐富的蛋白[19]。來源于周圍神經(jīng)的ECM主要由Ⅰ型膠原(約90%)組成，因此,Ⅰ型膠原常用于組織工程神經(jīng)的構(gòu)建[20, 21]。實(shí)驗(yàn)證明膠原導(dǎo)管和硅膠管用于橋接10 mm 神經(jīng)缺損，8 周后膠原導(dǎo)管比硅膠管更能促進(jìn)軸突再生、髓鞘形成及血管生成[22]。Yu 等[23]利用電紡絲技術(shù)制造出一種膠原/PCL 支架并探索其在引導(dǎo)神經(jīng)再生方面的作用；體外實(shí)驗(yàn)證明膠原/PCL制成的膜可促進(jìn)SC黏附和增殖；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明膠原/PCL 支架能成功地橋接SD大鼠8 mm 神經(jīng)缺損。

2 層粘連蛋白

層粘連蛋白是周圍神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，主要由雪旺細(xì)胞產(chǎn)生并廣泛分布于細(xì)胞表面，它是基底膜中由糖蛋白類、Ⅳ型膠原和蛋白聚糖類形成的緊密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中普遍存在的成分，主要存在于周圍神經(jīng)的內(nèi)膜和束膜[24]。層粘連蛋白可能是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的一類ECM蛋白質(zhì), 在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中扮演重要的角色，具有多樣化的功能，包括神經(jīng)元遷移、軸突外生、髓鞘形成、神經(jīng)肌肉接頭的形成[25]。層粘連蛋白的存在刺激不同雪旺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)出更長(zhǎng)的神經(jīng)突[26]；在缺乏雪旺氏細(xì)胞層粘連蛋白G1的小鼠表現(xiàn)為雪旺細(xì)胞增殖、分化減少，生存和徑向分類障礙，神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低和神經(jīng)髓鞘形成不良[27,12]。層粘連蛋白在周圍神經(jīng)再生過程中起重要作用，因此在神經(jīng)損傷的修復(fù)中，常與其他材料(膠原、殼聚糖等)結(jié)合來促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[28, 29]。Deister等[30]研究發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)的移植物在層粘連蛋白的凝膠上比在纖連蛋白、Ⅰ型膠原或透明質(zhì)酸凝膠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更好。Seo等[31]用層粘連蛋白-2來源的肽包裝PPD(聚對(duì)二氧環(huán)己酮)/PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)導(dǎo)管來引導(dǎo)一段10 mm缺損的大鼠坐骨神經(jīng)再生，發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白-2可以促進(jìn)神經(jīng)早期的再生速率，顯著增強(qiáng)再生有髓神經(jīng)纖維的密度以及減少外來的多核巨細(xì)胞的滲入，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。

3 纖連蛋白

纖連蛋白首先由Akers等[32]從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它是一種細(xì)胞表面相關(guān)的糖蛋白，含有不同的功能域，可與不同的分子(纖維蛋白、膠原、肝素)相結(jié)合，其中有兩個(gè)功能域與細(xì)胞黏附和神經(jīng)再生有關(guān)[33]。纖連蛋白在基本上所有組織的細(xì)胞發(fā)育過程中高度表達(dá),通過和整聯(lián)蛋白、膠原、其他細(xì)胞受體以及許多其他ECM組分的相互作用在組織受損后的重建中提供支架方面起重要作用[34]。在培養(yǎng)皿中，相較于層粘連蛋白，纖連蛋白對(duì)于成人背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用很微弱，但在外周神經(jīng)損傷之后，纖連蛋白的基因在拼接上會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)不同的亞型，其中一些具有極強(qiáng)的促進(jìn)生長(zhǎng)的潛力[35,36];它可促進(jìn)多種神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)，包括胚胎背根神經(jīng)元/交感神經(jīng)元和脊髓前角神經(jīng)元，而它更重要的功能是為軸突再生提供纖維基質(zhì)支持，促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移[11]。纖連蛋白的糖基化影響它促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)的能力[37],在組織工程神經(jīng)構(gòu)建中，纖連蛋白經(jīng)常單獨(dú)或與其他成分一起添加來增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)效果，例如，Ding等[38]用嵌入了納米銀的膠原支架，內(nèi)面涂有層粘連蛋白和纖連蛋白，來橋接大鼠10 mm的坐骨神經(jīng)缺損，證明其有助于軸突再生，并且神經(jīng)功能恢復(fù)效果比單純的自體神經(jīng)移植好。Mukhatyar等[39]研究發(fā)現(xiàn)纖連蛋白可以促進(jìn)SC的遷移和軸突在靜電紡絲纖維基膜上的生長(zhǎng)。最近有報(bào)道指出，培養(yǎng)的成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞(來源于皮質(zhì)和海馬)在纖連蛋白中比在層粘連蛋白-111或112中生長(zhǎng)好[40]；故而說明纖連蛋白在神經(jīng)修復(fù)的過程中調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞和軸突反應(yīng)方面是一種重要的ECM蛋白。由此可見，使用纖連蛋白或許可制作長(zhǎng)段導(dǎo)管用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。

4 腱糖蛋白C(tenascin C,TNC)

細(xì)胞外基質(zhì)的一個(gè)主要組成部分是腱糖蛋白-C(TNC)，它是由成熟和不成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)細(xì)胞、腦膜纖維細(xì)胞、神經(jīng)元子集和雪旺細(xì)胞表達(dá)的。TNC存在于成人的大多數(shù)健康組織中，但是在一些病理情況下，比如創(chuàng)傷、感染和腫瘤，就可以被顯著誘導(dǎo)增長(zhǎng)[41]。早就發(fā)現(xiàn)TNC具有多種功能，比如可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和癌細(xì)胞的新陳代謝[42,43]，并且可以在神經(jīng)系統(tǒng)中通過整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)方向[44]。在體內(nèi)，當(dāng)損傷產(chǎn)生后，TNC的表達(dá)會(huì)上調(diào)，近來有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷部位的纖維母細(xì)胞常與TNC一同出現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)在周圍神經(jīng)損傷之初，TNC的水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)；在體外，TNC調(diào)節(jié)SC的遷移，并且發(fā)現(xiàn)在SC和纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)的環(huán)境里，敲除了TNC基因的纖維母細(xì)胞能降低SC的遷移能力[45]。研究還發(fā)現(xiàn)TNC通過包括β1整聯(lián)蛋白在內(nèi)的細(xì)胞表面受體來與細(xì)胞產(chǎn)生相互作用[46]。Zhang[45]通過實(shí)驗(yàn)證明了在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)過程中，纖維母細(xì)胞來源的TNC直接與SC表面的β1整聯(lián)蛋白結(jié)合，激活Rac1酶，通過下游效應(yīng)來促進(jìn)SC的遷移。目前公認(rèn)在病理狀態(tài)下的低氧水平或者細(xì)胞因子分泌可以引起TNC的上調(diào)[47]；健康和受損傷外周神經(jīng)的TNC差異性表達(dá)以及它對(duì)于SC遷移的復(fù)雜影響闡明了外周神經(jīng)的修復(fù)可能受纖維母細(xì)胞來源的TNC的特定水平的動(dòng)態(tài)影響。

5 神經(jīng)營養(yǎng)因子

神經(jīng)營養(yǎng)因子是指機(jī)體產(chǎn)生的能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化的一類蛋白質(zhì)因子。神經(jīng)營養(yǎng)因子不僅在成年神經(jīng)系統(tǒng)存在，而且能夠阻止成年神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元的死亡以及調(diào)節(jié)包括突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等許多神經(jīng)系統(tǒng)功能，不僅可以減少神經(jīng)變性，阻止疾病進(jìn)程，而且還具有刺激軸突生長(zhǎng)、促進(jìn)再生的功能[48]。SC通過和ECM分子相互作用從而被激活，釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)，已發(fā)現(xiàn)有特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分的特異性親和力[49], 例如，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對(duì)纖維蛋白原有良好的親和力。在神經(jīng)再生過程中，細(xì)胞與ECM蛋白的相互作用在控制細(xì)胞的附著、遷移、增殖和分化中起重要作用[50]，這些相互作用也引導(dǎo)了細(xì)胞因子激活、細(xì)胞凋亡，并負(fù)責(zé)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[51]。

早期對(duì)于神經(jīng)支架的嘗試是使用純化的ECM單成分，比如膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和透明質(zhì)酸等[52～54]，但都以失敗而告終[55]。相較于單一成分ECM制備的支架，組織來源ECM 的支架能夠更好的保持天然神經(jīng)的基本結(jié)構(gòu)及促進(jìn)周圍神經(jīng)的修復(fù)[56]。Gu等[57]組裝了一個(gè)以殼聚糖/絲心蛋白為基礎(chǔ)的、SC來源的、ECM修飾的支架，來橋接大鼠坐骨神經(jīng)10 mm的缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過ECM改良的支架對(duì)于神經(jīng)再生修復(fù)的支持比單純支架顯著有效。因此，ECM修飾的神經(jīng)移植物作為分子和細(xì)胞的替代品在神經(jīng)損傷的治療方面擁有廣闊的前景，未來的研究必然會(huì)向ECM改良的神經(jīng)移植方向發(fā)展。

目前神經(jīng)支架存在的主要問題是這些神經(jīng)營養(yǎng)趨化因子在神經(jīng)導(dǎo)管中降解失活較快，尤其通透性較大的生物型導(dǎo)管；新的給藥及控釋技術(shù)顯示了良好的前景，能夠在神經(jīng)再生的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放這些因子。另一問題是現(xiàn)在大多數(shù)是以單個(gè)因子作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，各種因子的最佳組合配方尚不清楚。外周神經(jīng)的細(xì)胞和分子治療還面臨著一些問題，如：細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的應(yīng)用種類和數(shù)量、它們的分子遞呈、細(xì)胞的生存及因子活性、細(xì)胞表型穩(wěn)定性、治療時(shí)機(jī)的調(diào)控以及昂貴的費(fèi)用等[58]，均需要進(jìn)一步研究，以期獲得一種高效、經(jīng)濟(jì)、易獲得的神經(jīng)修復(fù)支架。