幽門螺旋桿菌候選疫苗抗原的研究進(jìn)展①

趙 翠 趙福廣 黃利亞

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118)

1 前言

HP是一種螺旋形，寄居于人胃黏膜上的一種革蘭氏陰性微需氧菌，對(duì)生長條件要求十分苛刻。HP不依賴組織入侵的方式定植于胃上皮黏膜，這在很大程度上有利于逃避宿主免疫機(jī)制，同時(shí)，HP有整合環(huán)境DNA的能力，這種能力增加了HP在變化的環(huán)境中得以生存的機(jī)會(huì)[1]。HP感染后的臨床表現(xiàn)多樣性提示了HP致病機(jī)制的復(fù)雜性。在與疾病的相關(guān)性方面，HP是慢性胃炎、十二指腸潰瘍等的主要致病菌，且與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(Mucosa associated lymphoid tissue,MATL)惡性淋巴瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系。最近的研究表明[2]，HP與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)聯(lián)性呈上升趨勢，此外在多發(fā)性硬化患者中HP檢出率極低，推測HP可能是發(fā)展多發(fā)性硬化的保護(hù)因子[3]。在對(duì)HP疫苗的探究過程中，圍繞全菌體抗原進(jìn)行的攻毒試驗(yàn)獲得了較為理想的免疫保護(hù)率，但因其成分復(fù)雜，安全性差等缺點(diǎn)，將其作為疫苗應(yīng)用于人體，還需進(jìn)一步研究。因此，研制一種經(jīng)濟(jì)、高效、安全的治療性疫苗是防治HP感染的有效途徑，而篩選高效抗原又是疫苗研制工作的重中之重，本文就HP疫苗的候選抗原的研究近況及發(fā)展前景作一綜述。

2 抗原研究進(jìn)展

2.1尿素酶 尿素酶(Urase)位于細(xì)菌表面，包括UreA和UreB兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其豐富的蛋白含量約占全菌蛋白的5%～10%。在HP的致病機(jī)制方面，尿素酶主要通過水解尿素產(chǎn)生氨和二氧化碳，調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞周圍的pH值，是HP在高強(qiáng)度胃酸中得以生存和定植的關(guān)鍵[4]，同時(shí)尿素酶是HP重要的定植因子和毒力因子，因此，“無酸無潰瘍”的傳統(tǒng)觀點(diǎn)已經(jīng)被打破。

目前，對(duì)尿素酶的研究比較廣泛，秦玉紅等[5]將純化的rUreB蛋白加弗氏佐劑經(jīng)腹腔注射免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性抗體，測得小鼠血清中的IgG抗體水平較對(duì)照組相比顯著增加，同樣的結(jié)果體現(xiàn)在Zhang等[6]的研究中。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)將尿素酶和其他能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的抗原聯(lián)合制成二價(jià)或多價(jià)疫苗，可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫效果。林煥建等[7]通過UreB和過氧化氫酶加免疫佐劑CT制成二價(jià)口服疫苗，獲得了近83.4%的免疫保護(hù)率，與單價(jià)疫苗組即過氧化氫酶加CT組的41.7%和UreB加CT組的54.2%相比獲得了較為理想的免疫效果，且二價(jià)疫苗組中小鼠胃黏膜中HP的定植密度也明顯降低。更多可喜的研究結(jié)果體現(xiàn)在Zhou等[8,9]的研究中。

雖然不同地區(qū)的HP菌株具有多樣性和易變異等特點(diǎn)，但不同HP菌株間UreB的核酸序列具有高度的保守性和同源性，且分子量大，特異性強(qiáng)，能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫保護(hù)作用，與UreA相比，UreB具有更好的免疫保護(hù)作用[10]。因此，UreB被列為最有前景的候選抗原之一。

2.2空泡毒素和細(xì)胞毒素

2.2.1空泡毒素 空泡毒素相關(guān)基因A (Vacuolat-ing cytotoxin gen A，VacA)編碼的VacA蛋白是HP中重要的毒力因子和致病因子。有研究表明，VacA和CagA基因的可變序列可能是HP菌株多樣性和易變異的主要原因。目前，根據(jù)VacA和CagA的表達(dá)情況，可將HP分為兩類：Ⅰ型(CagA+VacA+)和Ⅱ型(CagA-VacA-)。

VacA是一種約含有860個(gè)氨基酸殘基的多功能蛋白，該毒素通過在靶細(xì)胞膜上形成小孔，導(dǎo)致細(xì)胞中離子和小分子物質(zhì)泄漏。VacA最重要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜孔隙與空泡的形成，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞空泡樣損傷[11]。Chiozzi等[12]研究表明：VacA可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而VacA與氯化銨聯(lián)合作用，在誘發(fā)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還可使人胃上皮細(xì)胞加速凋亡。Hasanzadeh等[13]將VacA的抗原區(qū)克隆到載體PET32a中，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)目的蛋白，結(jié)果表明VacA蛋白不但具有抗原性，且重組VacA蛋白能夠與HP患者血清中IgG特異性識(shí)別。由以上結(jié)果不難看出VacA作為HP疫苗候選抗原的潛力，并推測VacA可以用于HP診斷試劑和HP疫苗的發(fā)展，但VacA單獨(dú)作為抗原對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)并評(píng)價(jià)免疫效果的研究很少，一般是與細(xì)胞毒素相關(guān)基因A或其他抗原聯(lián)合應(yīng)用。

2.2.2細(xì)胞毒素 細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(Cytotoxin-associated gen A，CagA)的表達(dá)產(chǎn)物CagA蛋白是一種免疫原性較強(qiáng)，存在于菌體表面的外膜蛋白。CagA基因5′端高度保守，不同毒力菌株之間的同源性高達(dá)80%以上，可以作為候選抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與此相反的CagA基因3′端相對(duì)多變，含有不同數(shù)量的重復(fù)序列。CagA是HP中能增強(qiáng)胃炎、消化性潰瘍的一種重要的毒力因子，還可能是胃上皮細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素[14]。據(jù)早些年研究表明[15]，CagA陽性菌株常見于炎癥較為嚴(yán)重或胃癌患者中，這些患者胃上皮細(xì)胞中的AP-1和NFKB等轉(zhuǎn)錄因子活性升高，其激活可導(dǎo)致多種炎癥因子如IFN-γ、IL-2等的表達(dá)，從而加劇胃黏膜損傷。再者，T細(xì)胞的FasL基因啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)NF-κB和3個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)，CagA可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)T細(xì)胞FasL基因的表達(dá)，損害Fas陽性上皮細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞間“相互殘殺”。因此以上研究并不支持CagA用于候選抗原的應(yīng)用。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CagA基因完整的DNA序列因其含有非必需表位和較高分子質(zhì)量，不易克隆和表達(dá)。因此，研究者們選擇將CagA部分基因序列與其他抗原聯(lián)合，制備二價(jià)甚至多價(jià)疫苗，并在動(dòng)物模型中取得了較為可喜的成果，同時(shí)開啟了由HP單價(jià)疫苗轉(zhuǎn)向多價(jià)疫苗的時(shí)代[16,17]。

近些年來，對(duì)VacA和CagA的研究僅限于動(dòng)物模型，鮮有VacA和CagA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道，但對(duì)二者的研究熱度并沒有因此而減少。由于多抗原融合疫苗參與發(fā)病的不同階段，因而獲得了較為理想的免疫效果，為HP多價(jià)疫苗的發(fā)展提供一定的理論支持，HP多價(jià)疫苗可能是攻克HP感染道路上的成功一步。

2.3黏附素 黏附素(Helicobacter pylori adhesin A，Hpa A)是由Hpa A基因編碼的脂蛋白，不同HP菌株間高度保守，迄今為止，并沒有發(fā)現(xiàn)Hpa A陰性菌株。Hpa A介導(dǎo)HP的黏附與定植，具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，但發(fā)揮免疫保護(hù)作用的關(guān)鍵表位和分子機(jī)制尚不明確。有研究表明，Hpa A由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)三個(gè)部分組成，其中跨膜區(qū)和胞外區(qū)發(fā)揮免疫保護(hù)作用[18]，因此，F(xiàn)lach等[19]利用截短形式的HpaA聯(lián)合UreB免疫C57BL/6小鼠，與對(duì)照組全長的Hpa A聯(lián)合UreB相比較，HP特異性抗體IgG的滴度顯著升高。近期，Tobias等[20]構(gòu)建重組無毒的霍亂弧菌，將Hpa A和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定植因子(CFA/I)共表達(dá)(VC-HpaA-CFA/I)，發(fā)現(xiàn)與VC-HpaA相比，Hpa A水平在重組菌株VC-HpaA-CFA/I中的表達(dá)量更高，理論上，此種疫苗可以對(duì)抗包括大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、霍亂弧菌在內(nèi)的三種病原體，可能成為抗HP感染的潛在候選疫苗，為今后研制對(duì)抗多種病原體疫苗提供更多的理論支持，但此疫苗的安全性有待進(jìn)一步評(píng)估。

2.4過氧化氫酶 過氧化氫酶(Catalase，KatA)是一種高度保守，暴露于菌體表面的蛋白酶，約占HP菌體蛋白的1.5%左右。在功能上KatA與Urase似乎有著異曲同工之妙，KatA通過將有毒的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成水，保證代謝平衡的同時(shí)，保護(hù)HP免受中性粒細(xì)胞殺傷，是HP逃避宿主免疫的重要組成部分。同時(shí)KatA在pH<3的環(huán)境中仍可保持活性，是HP在胃黏膜極酸環(huán)境中得以定植和生存的關(guān)鍵。近些年，關(guān)于KatA表位疫苗的研究較多，并證實(shí)含有較少氨基酸序列的KatA表位疫苗等同甚至優(yōu)于KatA全序列疫苗[21,22]。隨著研究的深入，KatA抗原與疾病的關(guān)聯(lián)程度備受關(guān)注，尤其是在胃癌中。有研究表明[23]，較高的KatA抗體滴度在一定程度上可以預(yù)防胃癌的發(fā)生，并可以作為胃癌篩選的生物標(biāo)志物。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可以看出，在2010年甚至更早以前涌現(xiàn)了大量關(guān)于證實(shí)KatA免疫原性的研究[24,25]，為KatA作為HP疫苗候選抗原、KatA聯(lián)合其他抗原、KatA表位疫苗的發(fā)展提供理論依據(jù)。雖然表位疫苗的表位識(shí)別和正確組裝技術(shù)尚不成熟，表位之間的相互影響仍需探索，但KatA表位疫苗已經(jīng)展現(xiàn)了不俗的發(fā)展前景，這為探究HP疫苗的大方向奠定基礎(chǔ)。

2.5膜炎性蛋白 膜炎性蛋白(Outer inflammatory protrin,OipA)由hopH基因編碼，相對(duì)分子質(zhì)量約34 kD。關(guān)于OipA與臨床疾病的關(guān)系尚無統(tǒng)一定論，有研究發(fā)現(xiàn)，在胃潰瘍患者中OipA+HP的總檢出率高達(dá)100%，顯著高于胃炎患者26.2%的檢出率。相似的結(jié)果也體現(xiàn)在Markovska等[26]的研究中，OipA幾乎表達(dá)于從消化性潰瘍患者分離的所有菌株中(97%)，在胃炎患者中分離的菌株中較少(66%)。但在最近的研究卻展現(xiàn)相反的結(jié)果，OipA與胃部疾病無關(guān)聯(lián)，不能作為預(yù)測診斷胃腸疾病的標(biāo)志[27]。

目前，對(duì)于OipA能否直接影響促炎性信號(hào)還存在爭議，有研究表明，功能性的hopH基因失活導(dǎo)致IL-8分泌減少50%左右，因此功能性的OipA在IL-8的誘導(dǎo)中起著重要作用。與此相反，在Dossumbekova等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)hopH基因表達(dá)與IL-8分泌并沒有相關(guān)性。出現(xiàn)上述兩種結(jié)果的原因可能是菌種的區(qū)域性差異，因此，不同地理區(qū)域的臨床報(bào)告預(yù)測毒力因子與疾病的發(fā)生結(jié)果是有爭議的。

2.6十二指腸潰瘍促進(jìn)因子 DupA(Duodenal ulcer promoting gene，DupA)被稱為十二指腸潰瘍促進(jìn)因子，因常見于十二指腸潰瘍患者中而得名。DupA是近些年研究的熱門，因此，圍繞DupA的相關(guān)研究并不完善，研究結(jié)果不盡相同甚至相反。有研究表明[29]，不同區(qū)域DupA陽性檢出率不同，且與臨床疾病無顯著相關(guān)性，該研究還發(fā)現(xiàn)，DupA的存在與否與HP的其他毒力因子無關(guān)。同年Shiota等[30]表明，DupA與十二指腸潰瘍密切相關(guān)，但與胃癌的關(guān)系尚不明確。近年來Souod等[27]通過研究DupA、OipA與胃部疾病的關(guān)系中指出，DupA可以作為預(yù)測十二指腸潰瘍的標(biāo)志物和胃癌的抑制因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HP中的一些毒力因子并不單獨(dú)存在，而是與其他毒力因子聯(lián)合形成“協(xié)同活性”，此研究結(jié)果與Shiota等[30]完全相反。最近，在探索HP中毒力因子與胃部疾病的關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn)，HP中的毒力因子之間存在關(guān)聯(lián)性(VacA、CagA、DupA、OipA)，這種關(guān)聯(lián)性與胃部疾病聯(lián)系緊密，特別是胃炎[31]。以上種種結(jié)果不難看出，雖然圍繞DupA的相關(guān)研究日漸廣泛，但關(guān)于DupA與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性尚無統(tǒng)一定論，且目前并沒有關(guān)于DupA作為候選抗原制成HP疫苗的相關(guān)報(bào)道。

2.7脂多糖 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因子，被認(rèn)為是引起黏膜炎癥反應(yīng)的一種強(qiáng)效內(nèi)毒素，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生[32]。LPS主要表達(dá)LewisX和LewisY抗原決定簇，HP患者產(chǎn)生Lewis抗原決定簇抗體并通過自身免疫反應(yīng)造成胃黏膜損傷和潰瘍創(chuàng)面形成[33]。此外LPS促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)，并在受試小鼠體內(nèi)檢測到細(xì)胞因子IFN-γ增加，這可能是消除HP感染的關(guān)鍵[34]。在對(duì)此種抗原的學(xué)習(xí)和查閱文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，LPS的研究現(xiàn)狀處于探究其生物活性，評(píng)價(jià)免疫原性階段，且對(duì)其引起免疫應(yīng)答的類型處于研究探索中，因此，尚且沒有LPS作為抗原或與其他抗原聯(lián)合制備HP疫苗的相關(guān)報(bào)道。

3 前景展望

除上述幾種抗原外，中性粒細(xì)胞激活蛋白(Nap)[35,36]、熱休克蛋白(Hsp)[37,38]都有作為候選抗原的相關(guān)報(bào)道，在這里不再一一概述。就HP疫苗的研究現(xiàn)狀而言，HP疫苗仍處于實(shí)驗(yàn)階段，現(xiàn)階段的研究成果尚不能完全清除體內(nèi)感染和阻斷HP傳播，且保護(hù)率不高的問題在國內(nèi)外一直未有突破。目前為止，尚且沒有HP疫苗進(jìn)入臨床的相關(guān)報(bào)道，因此，現(xiàn)階段的治療方式仍以抗生素治療為主，但抗生素耐藥性(克拉霉素)成為應(yīng)用抗生素治療失敗的主要原因[39]，基于目前理論研究成果，推薦使用益生菌[40,41]和中藥制劑作為輔助治療。

HP疫苗的研究尚存在許多問題，但取得的成果不容忽視，Naz等[42]基于反向疫苗學(xué)方法預(yù)測HP疫苗的潛在候選抗原，并預(yù)測VacA、BabA、Hpa A等是首要候選抗原?，F(xiàn)如今，大部分的臨床研究已經(jīng)運(yùn)用重組尿素酶作為抗原?；蛟S研究不同抗原組合的多價(jià)疫苗、篩選高效抗原并增加抗原的表達(dá)量、探索HP表位疫苗中表位結(jié)合的新型方式是HP疫苗未來的發(fā)展方向。隨著生物學(xué)、信息科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，HP疫苗的研制必將取得成功。

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