咽喉反流性疾病相關(guān)動(dòng)物模型研究進(jìn)展*

宋徽 張延平

咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease，LPRD)是指胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位，引起一系列癥狀和體征的總稱[1]。既往有學(xué)者認(rèn)為該病是胃食管反流病的食管外表現(xiàn)，近年來(lái)研究證實(shí)存在咽喉反流性疾病者并不一定伴發(fā)反流性食管炎[2]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于該病的基礎(chǔ)研究較少，發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，因此，選擇和建立有效的LPRD動(dòng)物模型，不僅有助于進(jìn)一步了解該病的發(fā)生發(fā)展，更可為臨床治療方案的選擇提供理論依據(jù)；為便于建立咽喉反流性疾病相關(guān)動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討其可能的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外LPRD相關(guān)動(dòng)物模型建立的方法綜述如下。

1 LPRD相關(guān)動(dòng)物模型建模動(dòng)物的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的LPRD相關(guān)動(dòng)物模型的建模動(dòng)物主要選擇小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羔羊、家豬等[3～6]。由于不同物種間解剖結(jié)構(gòu)及組織形態(tài)存在差異，選擇最接近人類咽喉結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)于咽喉反流性疾病病理變化及分子機(jī)制的研究至關(guān)重要。Gill等[7]對(duì)小鼠、大鼠、兔、豚鼠、家豬的正常咽喉部組織進(jìn)行組織學(xué)、分子結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有豬的咽喉部組織存在復(fù)層鱗狀上皮和假纖毛柱狀上皮，且上皮細(xì)胞間存在緊密連接復(fù)合體的表達(dá)，與人類咽喉部結(jié)構(gòu)最相似，認(rèn)為豬是最合適研究咽喉反流性疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。然而，由于家豬體積較大，飼養(yǎng)難度高，目前多用于離體組織的觀察[8，9]。因此，從以上研究來(lái)看，如果實(shí)驗(yàn)條件較成熟，將豬作為L(zhǎng)PRD的活體實(shí)驗(yàn)研究是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最佳選擇。

2 動(dòng)物模型的制備方法

目前, 文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)建立LPRD動(dòng)物模型的方法基本都是沿用了胃食管反流病動(dòng)物模型的建模方法，用于研究胃食管反流時(shí)咽喉粘膜的相關(guān)變化，一般是通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩種途徑建立動(dòng)物模型。

2.1內(nèi)源性方法 主要是通過(guò)手術(shù)改變胃腸道解剖使胃內(nèi)容物、十二指腸液或兩者的混合物反流，從而導(dǎo)致咽喉炎癥，手術(shù)方式包括：破壞賁門(mén)結(jié)構(gòu)或功能、結(jié)扎幽門(mén)和近端小腸、插鼻飼管等方法。

2.1.1賁門(mén)肌松弛術(shù) Hu等[4,10]為新西蘭白兔行全賁門(mén)肌切開(kāi)術(shù)，于術(shù)后2周和8周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行食管pH監(jiān)測(cè)、喉鏡檢查、反流體征評(píng)分(reflux finding score，RFS)、組織學(xué)檢查，pH監(jiān)測(cè)術(shù)后反流頻率、反流指數(shù)、最長(zhǎng)反流持續(xù)時(shí)間，可見(jiàn)24小時(shí)反流次數(shù)明顯增加；術(shù)后8周行喉鏡檢查，RFS評(píng)分明顯增加；組織學(xué)檢查見(jiàn)術(shù)后咽喉部炎癥淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)評(píng)分、粘膜下腺體增生計(jì)數(shù)評(píng)分明顯升高；表明模型兔慢性食管下括約肌功能障礙與反流有關(guān)；術(shù)后12周取食管和咽喉標(biāo)本行組織學(xué)和電子顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)咽喉部組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞間隙顯著擴(kuò)大、橋粒數(shù)目減少，并在食管樣本中觀察到伴有乳頭樣增生的鱗狀上皮。為了在分子水平上進(jìn)一步研究喉咽部蛋白表達(dá)生物學(xué)特征，Hu等[11]又通過(guò)對(duì)Wistar大鼠實(shí)施賁門(mén)肌肉切除，成功構(gòu)建了大鼠的反流性疾病模型，并對(duì)手術(shù)后12周動(dòng)物近端食管和喉部粘膜進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和緊密連接蛋白Claudins-3蛋白表達(dá)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高倍鏡下觀察上述兩個(gè)部位組織的淋巴細(xì)胞數(shù)量增加、Claudins-3表達(dá)顯著減少，提示反流導(dǎo)致了食管和喉部淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，而Claudins-3表達(dá)減少與反流性疾病組織中細(xì)胞間隙擴(kuò)大的形態(tài)學(xué)特征有關(guān)，提示Claudins-3表達(dá)可能是大鼠反流性喉炎的敏感指標(biāo)。

2.1.2賁門(mén)置管術(shù) 汪忠鎬等[12]通過(guò)切開(kāi)SD大鼠胃腔，將擴(kuò)張管逆向從胃經(jīng)賁門(mén)插入食管，在幽門(mén)下0.5 cm處結(jié)扎，對(duì)照組僅行幽門(mén)下結(jié)扎而不植入擴(kuò)張管，兩組均向胃腔內(nèi)注入亞甲藍(lán)1 ml，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物在手術(shù)后10小時(shí)和17小時(shí)死亡，尸檢結(jié)果顯示食管、氣道、咽喉、口腔及鼻腔均可見(jiàn)藍(lán)色附著，而對(duì)照組尸檢顯示食管內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)色液體溢出，氣道、咽喉、口腔、鼻腔均未見(jiàn)藍(lán)染，提示在胃食管反流中存在胃食管、喉氣管反流。Feng等[13]對(duì)上述手術(shù)方式進(jìn)行了改進(jìn)，在內(nèi)鏡下于巴馬豬的食管上段和賁門(mén)處放置金屬網(wǎng)狀支架，術(shù)后3天取出支架，術(shù)后14天行pH監(jiān)測(cè)后取咽喉組織標(biāo)本行透射電鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反流次數(shù)、反流時(shí)間和pH<4.0的反流事件的百分比明顯增加，透射電鏡檢查可見(jiàn)手術(shù)組與空白對(duì)照組相比，咽喉部粘膜細(xì)胞間隙擴(kuò)大，橋粒明顯減少，提示咽喉反流性疾病破壞了喉粘膜細(xì)胞間的屏障。該手術(shù)方法創(chuàng)傷小，動(dòng)物耐受性好，術(shù)后存活率高，且豬的喉咽部組織結(jié)構(gòu)與人類更為接近，是目前較為理想的動(dòng)物模型制備方式。

2.1.3幽門(mén)縮窄手術(shù) 限制幽門(mén)排空造成幽門(mén)狹窄也是文獻(xiàn)報(bào)道的另一種制作反流性疾病動(dòng)物模型的方法。Habesoglu等[14]使用SD大鼠進(jìn)行該模型構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)組腹腔麻醉后，用一段18FR的尼龍導(dǎo)管將幽門(mén)環(huán)附近的十二指腸在前胃和腺體部之間用不可吸收線結(jié)扎，完成模型制作，對(duì)照組行假手術(shù)，分別于術(shù)后1周、4周和12周觀察軟腭的組織學(xué)改變；結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組軟腭粘膜下腺體增生、上皮下水腫、血管迂曲、肌肉萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體外分泌管擴(kuò)張，均有顯著差異，這些病理變化反映了LPRD與氣道堵塞的關(guān)系。Shimazu等[15]用絲線將Wistar大鼠胃底部結(jié)扎減少胃容積，并將Nelaton軟導(dǎo)管套于幽門(mén)處以減緩胃排空，觀察術(shù)后2周至20周動(dòng)物胃食管大體形態(tài)改變，并取咽、喉、氣管、肺、食管行組織學(xué)檢查，術(shù)后第8周見(jiàn)下咽部粘膜增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后12周可見(jiàn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原纖維沉積，術(shù)后第16周胸段食管神經(jīng)細(xì)胞、杓狀軟骨和肺組織中發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，術(shù)后第18周可見(jiàn)下咽部粘膜固有層乳頭增生，毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)鲋?，證實(shí)胃酸反流所致的炎性反應(yīng)已延伸至咽喉部。

2.1.4鼻飼管置管術(shù) 插鼻飼管是臨床上對(duì)于咽喉及胃腸疾病治療常用的操作，很多患者存在反酸、噯氣及咽喉不適，目前對(duì)該癥狀出現(xiàn)原因的研究不多見(jiàn)。Marinho等[16]通過(guò)對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)這種鼻飼管引起的不適癥狀與反流導(dǎo)致的咽喉炎癥有關(guān)，他們通過(guò)麻醉動(dòng)物后將10～13 cm長(zhǎng)的鼻飼管經(jīng)Wistar大鼠前鼻孔、鼻咽部插入胃內(nèi)，1周后處死動(dòng)物檢測(cè)動(dòng)物喉組織中過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性、局部炎癥及膠原纖維沉積情況；結(jié)果顯示鼻飼管組動(dòng)物喉部組織中MPO活性顯著增加，粘膜下可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可能與鼻飼管影響食管括約肌功能造成的反流性炎癥有關(guān)，而105J/cm2的紅外激光可以減輕上述組織反應(yīng)。

上述內(nèi)源性方法制備的均為胃食管反流動(dòng)物模型，觀察胃食管反流的食管外表現(xiàn)，其優(yōu)點(diǎn)是可以研究反流疾病的急性病理生理，但也存在一定的局限性，如：動(dòng)物需要很強(qiáng)的耐受性方可接受手術(shù)，手術(shù)者也需要有較高的手術(shù)技巧；動(dòng)物常死于各種手術(shù)并發(fā)癥，影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展；因此，內(nèi)源性LPRD動(dòng)物模型制作方法的應(yīng)用也受到一定的限制，同時(shí)該方法對(duì)非酸反流等發(fā)病機(jī)制不能做很好的解釋。

2.2外源性方法

該方法主要是通過(guò)向活體動(dòng)物咽喉部組織灌注胃酸、胃蛋白酶、膽鹽等，利用上述物質(zhì)的化學(xué)性刺激損傷咽喉粘膜上皮，導(dǎo)致炎癥和潰瘍，從而構(gòu)建LPRD模型。

2.2.1酸和胃蛋白酶 Koufman等[17]于1991年最先使用了酸和/或胃蛋白酶，每周3次直接涂抹于獵狗聲門(mén)下喉部粘膜創(chuàng)面，觀察喉部創(chuàng)面愈合的情況；2周后處死動(dòng)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接觸酸的組織愈合時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)，而接觸酸和胃蛋白酶的組織不愈合；唾液中的硝酸鹽一旦與胃酸接觸，可產(chǎn)生亞硝胺類物質(zhì)，可誘發(fā)食管上皮或上消化道上皮惡變，認(rèn)為該機(jī)制可能與無(wú)煙酒嗜好但有反流者上消化道鱗癌的發(fā)生有關(guān)。

由于使用的動(dòng)物種類不同、方法各異，獲得的結(jié)果也不盡相同。Durkes等[18]為了研究酸和胃蛋白酶對(duì)聲帶上皮結(jié)構(gòu)的影響，用內(nèi)鏡噴灑導(dǎo)管將酸和胃蛋白酶直接滴在每側(cè)聲帶膜部，反流組噴灑pH3～4 的酸化胃蛋白酶(1.0毫克/毫升)1.5毫升，對(duì)照組則噴灑1.5毫升生理鹽水，每周重復(fù) 3 次，共持續(xù)4周，第12次操作后采集喉組織標(biāo)本；觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組聲帶組織病理學(xué)改變、彈性纖維及膠原纖維的數(shù)量和形態(tài)、相關(guān)蛋白表達(dá)(上皮屏障蛋白、上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及促炎癥因子)等均無(wú)明顯差異，上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間隙、微嵴高度無(wú)明顯改變，結(jié)果提示健康的聲帶上皮能夠抵御酸性胃蛋白酶的侵襲。

2.2.2膽鹽 脫氧膽酸在Barret食管(食管下段的鱗狀上皮被柱狀上皮覆蓋)發(fā)生中起重要作用，研究提示脫氧膽酸可以通過(guò)NF-κB途徑誘導(dǎo)DNA損傷和凋亡抵抗，而鵝去氧膽酸可以引起喉粘膜發(fā)生炎癥浸潤(rùn)。為探討膽鹽在下咽癌發(fā)病機(jī)制中的作用，Vageli等[19]采用塑料飼養(yǎng)管將不同pH值、伴有或不伴有鵝去氧膽酸的脫氧膽酸液體滴入小鼠下咽和食管上端，每天兩次，45天后行組織學(xué)檢查(觀察上皮異常增生、上皮厚度)、免疫組化(p- NF-κB)、免疫熒光[rp-NF-κB (S536)、Ki67、ΔNp63、CK14、E-cadherin、β-cateni及p-STAT3 (Tyr705)]檢測(cè)，結(jié)果提示與單純酸暴露和其他對(duì)照組相比，免疫組化和自動(dòng)定量分析都顯示暴露于十二指腸液體的小鼠下咽粘膜出現(xiàn)明顯的NF-κB活化和癌前改變，癌前改變組織中細(xì)胞增生因子Ki67、CK14和ΔNp63表達(dá)增加, 細(xì)胞粘附分子 E-Cadherin減少，脫氧膽酸、鵝去氧膽酸和酸性膽鹽暴露組動(dòng)物出現(xiàn)了咽喉上皮的異常增生或輕度不典型增生，脫氧膽酸暴露的動(dòng)物下咽粘膜出現(xiàn)了中度不典型增生，該結(jié)果支持十二指腸成分中的膽酸或膽酸成分誘導(dǎo)了小鼠上消化道鱗狀上皮分子改變和早期癌前病變，進(jìn)一步為反流性疾病是導(dǎo)致上消化道鱗狀上皮惡性腫瘤的學(xué)說(shuō)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

外源性方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)，可以長(zhǎng)時(shí)間觀察，但也存在局限性，一是灌流液與活體反流物完全不同，二是LPRD是一個(gè)涉及多方面因素的長(zhǎng)期慢性過(guò)程，單純通過(guò)化學(xué)刺激損傷咽喉粘膜難以完全解釋LPRD的發(fā)生和發(fā)展，只能用于研究咽喉和食管粘膜損傷和防御機(jī)制。

2.3離體實(shí)驗(yàn) 上皮細(xì)胞位于聲帶最外層，在保護(hù)聲帶固有層防止機(jī)械、化學(xué)、生物侵蝕等方面發(fā)揮重要作用[20],因此，喉部離體組織實(shí)驗(yàn)多采集聲帶上皮組織，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢查。Erickson-Direnzo等[8]采集豬離體聲帶上皮并給予丙烯醛、鹽酸、過(guò)氧化氫等干預(yù)后，對(duì)聲帶上皮細(xì)胞行Hoechst/Ethidium熒光染色檢查細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞代謝活性，結(jié)果表明鹽酸和過(guò)氧化氫干預(yù)組細(xì)胞膜完整性及細(xì)胞代謝活性下降，細(xì)胞生存能力降低，組織學(xué)檢查見(jiàn)上皮組織脫落、糜爛、水腫、分離、間質(zhì)水腫及空泡化，其維持屏障功能的能力受損。

細(xì)胞跨膜電阻是一種廣泛用于檢測(cè)食管、聲帶等復(fù)層鱗狀上皮屏障功能的指標(biāo)，阻力增大表明屏障功能增強(qiáng)，降低表明上皮滲漏增加、屏障功能受損[21]。Erickson等[22]模擬酸性反流，將豬離體聲帶上皮分別置于酸性蛋白酶、酸和蛋白酶中，結(jié)果顯示，酸和酸性蛋白酶組暴露30 min后即可出現(xiàn)細(xì)胞跨膜阻力降低，表明聲帶上皮細(xì)胞跨膜電阻可能對(duì)早期反流相關(guān)的上皮改變更為敏感，上皮屏障滲漏的增加導(dǎo)致反流事件對(duì)聲帶上皮和固有層的進(jìn)一步破壞。

隨著電生理研究的深入，聲帶上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道逐漸成為近年離體組織研究的熱點(diǎn)。Erickson-Levendoski等[23]將豬聲帶暴露于pH3的鹽酸、硫酸和胃蛋白酶中，60 s后鹽酸和硫酸組的聲帶離子轉(zhuǎn)運(yùn)一過(guò)性快速增加，且與碳酸氫鹽的分泌有關(guān)。Durkes等[24]用類似的方法證實(shí)了碳酸氫鹽的分泌可能有助于增強(qiáng)聲帶抗酸的能力，這一結(jié)果為碳酸氫鹽作為一種新型制劑用于治療咽喉反流性疾病提供了理論依據(jù)。

3 問(wèn)題與展望

文中所述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用不同種類的動(dòng)物和方法對(duì)LPRD的病因、機(jī)制及病理生理變化進(jìn)行了深入的探討，為該病的臨床治療提供了有價(jià)值的理論依據(jù)；但上述動(dòng)物模型都是LPRD與胃食管反流共存或非生理性反流，同時(shí)未涉及神經(jīng)、情緒、應(yīng)激等相關(guān)因素對(duì)發(fā)病的影響，在研究LPRD的發(fā)病機(jī)制、治療干預(yù)等方面還存在很大的局限性，因此，構(gòu)建單純生理性LPRD動(dòng)物模型將有助于對(duì)LPRD更進(jìn)一步的研究。

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