非編碼RNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展

傅 愉 綜述， 張 敬 審校

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

隨著基因組高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)ncRNAs種類繁多，長度差異大且不局限于是否剪切、是否為線狀結(jié)構(gòu)、是否具有polyA尾。

ncRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAs可在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，繼而影響神經(jīng)干細(xì)胞(neutral stem cell， NSC)向神經(jīng)元的定向分化，以及隨后的突觸和髓鞘發(fā)生等。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組分，這暗示著ncRNAs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)之間具有一定的相關(guān)性。

ncRNAs與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，不僅可以作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)記物，還可以誘導(dǎo)神經(jīng)再生[2-3]。隨著干細(xì)胞治療的興起，ncRNAs用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究與治療受到了廣泛關(guān)注[4-5]。

1 非編碼RNA的合成與功能

ncRNAs種類繁多，主要包括微小RNA(miRNAs)、長鏈非編碼RNA(lncRNAs)和環(huán)狀RNA(creRNA)等，目前研究較多的是miRNAs和lncRNAs。miRNAs高度保守，長度在22個(gè)核苷酸(nt)左右，其中有2～8nt的種子區(qū)可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別目標(biāo)mRNA。miRNA的生物合成過程主要包括形成、裂解、轉(zhuǎn)運(yùn)、剪切、單鏈降解這五個(gè)關(guān)鍵階段。pri-miRNA為miRNA的前體，在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生，長度為300～1000個(gè)堿基之后被RNase Ⅲ酶Drosha/DGCR8裂解產(chǎn)生短發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)pre-miRNA，通過5-RanGTP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。隨后，通過細(xì)胞質(zhì)中的核糖核酸酶Ⅲ酶Dicer將pre-miRNA剪切為20～25個(gè)核苷酸大小的成熟雙鏈miRNA，其中一條鏈被降解，由此形成成熟的單鏈miRNA。而lncRNAs長度大于200 nt，具有5’末端甲基鳥苷帽式結(jié)構(gòu)和polyA尾，與mRNA結(jié)構(gòu)相似，但缺乏可延伸的開放閱讀框，相比于miRNA，lncRNAs的形成過程更為多元，不僅可由編碼蛋白的基因斷裂形成，也可由染色質(zhì)重組、非編碼基因反義移位產(chǎn)生。

ncRNAs的功能集中在調(diào)控作用，miRNA的調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNAs可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。miRNA與Argonaute蛋白家族成員結(jié)合生成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silence complex, RISC)，結(jié)合到靶基因的mRNA的3’非翻譯區(qū)，導(dǎo)致其翻譯抑制或降解，從而負(fù)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。同樣地，相關(guān)lncRNA結(jié)構(gòu)分析研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs可與多梳復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子等關(guān)鍵表觀調(diào)控元件聯(lián)合作用，引起下游信號(hào)通路的改變，進(jìn)一步調(diào)節(jié)干細(xì)胞、腦發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2 非編碼RNA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

研究發(fā)現(xiàn)，許多ncRNAs可在CNS區(qū)特異性高表達(dá)，如miR-9、miR-124、lncRNA AK048794等，這暗示了ncRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育離不開神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSCs)。神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一類既具有多向分化潛能又可進(jìn)行自我更新的細(xì)胞，可分化形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)兩大重要神經(jīng)系統(tǒng)組分。NSCs向神經(jīng)元分化主要有三個(gè)過程，包括NSCs增殖、神經(jīng)分化和神經(jīng)成熟，而這幾個(gè)過程都可以受到ncRNAs的影響。

ncRNAs可以調(diào)控NSCs增殖過程。眾所周知，哺乳動(dòng)物CNS區(qū)中NSCs的數(shù)量穩(wěn)定至關(guān)重要。NSCs的缺乏可能引起人體的發(fā)育障礙，但NSCs的不斷增殖，不退出細(xì)胞分裂周期，則無法分化形成神經(jīng)元，同樣會(huì)產(chǎn)生發(fā)育障礙。已有實(shí)驗(yàn)證明，let-7b、miR-124，miR-9，miR-134和miR-137等miRNAs可以通過靶向不同的靶基因，調(diào)控NSCs的增殖和凋亡。ncRNAs調(diào)控NSCs的增殖過程，從而保證了NSCs的穩(wěn)定輸出[8-9]。

ncRNAs也可以調(diào)控NSCs向神經(jīng)元的分化。在神經(jīng)分化過程中，NSCs可通過對(duì)稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)NSCs或兩個(gè)祖細(xì)胞，或不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)干細(xì)胞和一個(gè)祖細(xì)胞[10]。神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells, NP)會(huì)進(jìn)一步分化為神經(jīng)元(neuron)，所以神經(jīng)元分化形成的過程依賴于ncRNA的精確調(diào)控。有研究證明，當(dāng)小鼠的多巴胺能神經(jīng)元中缺乏miRNA合成關(guān)鍵酶Dicer時(shí)，只能分化出比正常形態(tài)尺寸更小的神經(jīng)元，甚至?xí)剐∈竽X組織小于正常腦組織，這暗示了miRNA對(duì)神經(jīng)的分化具有重要的調(diào)控作用[11]。如let-7b、miR-9、miR-124在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，其表達(dá)水平逐漸上調(diào)，提示這些miRNA有利于神經(jīng)的發(fā)生[8-9]。而miR-124可通過靶向結(jié)合多個(gè)已證實(shí)的、與NSCs分化相關(guān)的基因，如PTBP1、SOX9、Ezh2等，進(jìn)而影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化[9,12]。同時(shí)，lncRNAs也對(duì)神經(jīng)分化有影響，例如在小鼠神經(jīng)發(fā)育過程中，lncRNA Pnky、LncRNA Paupar的敲低都會(huì)導(dǎo)致小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)分化的增強(qiáng)[13-14]。

ncRNAs還可以調(diào)控神經(jīng)元的成熟過程。目前研究表明，神經(jīng)元形成主要發(fā)生在哺乳動(dòng)物CNS區(qū)的海馬齒狀回(DG)的亞粒細(xì)胞區(qū)(SGZ)、側(cè)腦室的室下區(qū)(SVZ)和下丘腦[10]。之后進(jìn)入神經(jīng)成熟期，即已分化的神經(jīng)元通過rostral遷移流(RMS)遷移到嗅球變成中間神經(jīng)元[15]。因此神經(jīng)成熟期主要包括了神經(jīng)元遷移，突觸形成與髓鞘發(fā)生這三個(gè)過程，而ncRNAs與這些生物過程息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-134和miR-9可以影響神經(jīng)元遷移[16]，miR-138、miR-137、miR-132則可以影響鼠的突觸形成[17-18]。而有關(guān)lncRNAs的研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNA MSNP1AS過表達(dá)后神經(jīng)軸突數(shù)量出現(xiàn)減少，而缺乏lncRNA Evf2突觸生長則可受到抑制。另外，lncOL1、Six3os也能影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的生成，從而影響髓鞘的發(fā)生[3,19]。

不僅如此，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)ncRNAs對(duì)神經(jīng)發(fā)育的過程亦至關(guān)重要。ncRNAs在神經(jīng)外胚層分化、神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)決定和神經(jīng)元表觀遺傳印記等方面也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[20]。

3 非編碼RNA與神經(jīng)損傷修復(fù)

神經(jīng)損傷包括創(chuàng)傷性中樞系統(tǒng)損傷(Traumatic brain injury, TBI)和非創(chuàng)傷性中樞系統(tǒng)損傷。常見的病癥有腦卒中、阿爾茲海默癥、帕金森綜合征及其他神經(jīng)退行性疾病等。神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生后出現(xiàn)的病理變化之一是神經(jīng)元變性。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)與再生顯得尤為重要。

3.1 非編碼RNA與神經(jīng)疾病診斷

ncRNAs不僅與神經(jīng)再生相關(guān)，甚至可以作為一些神經(jīng)急性損傷或者神經(jīng)退行性疾病的潛在生物標(biāo)記物，如驚厥性發(fā)作、重性抑郁障礙、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病等[21]。例如，創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)患者的病情無論屬于輕度還是重度，其血漿中miR-16和miR-92a的表達(dá)量均高于正常人。除此之外，對(duì)于在缺血性腦卒中(Ischemic Injury, IS)這種疾病，分別在患者的外周血中和在該病的動(dòng)物模型I/R大鼠中發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p，Lnc RNA C2dat1的表達(dá)水平異常升高，可作為該病診斷的生物標(biāo)志物之一[22-23]。

3.2 非編碼RNA與神經(jīng)疾病治療

目前，ncRNAs參與的神經(jīng)干療法已經(jīng)在動(dòng)物模型水平表現(xiàn)出治療效果，研究發(fā)現(xiàn)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，以及誘導(dǎo)新的成神經(jīng)再生是治療的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

ncRNAs調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡的研究進(jìn)展表明，lncRNAs-N1LR和miR-592的表達(dá)上調(diào)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[24]，暗示了對(duì)IS小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，所以目前一種看法認(rèn)為ncRNAs可以通過抑制神經(jīng)元凋亡從而作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療候選物。

ncRNAs在調(diào)節(jié)神經(jīng)再生方面也有關(guān)鍵作用。正如目前已證實(shí)的miR-124、miR-137、miR-184與神經(jīng)再生直接相關(guān)，因此具有可觀的臨床治療前景[25-26]。此外，新生神經(jīng)元的進(jìn)一步成熟也受到ncRNA的調(diào)控。miR-433、lnc SCIR1和lncRNA MSNP1AS都可以通過靶向突觸形成關(guān)鍵基因，例如α-突觸核蛋白或者骨骼的表達(dá)形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)等，從而影響突觸形成[27]。甚至還有研究發(fā)現(xiàn)沒有miR-9活性的hNPC移植到胚胎期小鼠大腦或成年小鼠腦中風(fēng)模型的腦組織中，可增強(qiáng)神經(jīng)元遷移能力[28]。所以，ncRNAs可以通過刺激神經(jīng)再生途徑作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療候選物。

3.3 非編碼RNA與神經(jīng)疾病預(yù)后分析

ncRNAs的表達(dá)量具有時(shí)空特異性暗示了ncRNAs在分析神經(jīng)疾病預(yù)后中的作用。血清中Let-7e在缺血性卒中發(fā)生發(fā)展不同階段呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，在IS患者的恢復(fù)期表達(dá)水平最低，而在急性期表達(dá)水平最高。然而，IS患者血清中的miR-338表達(dá)量在任何階段都沒有顯著差異[29]。因此，miR-338和Let-7e表達(dá)量的變化情況可為IS患者的預(yù)后分析提供參考數(shù)據(jù)。不僅如此，通過對(duì)脊髓損傷小鼠模型的(spinal cord injury, SCI)血清進(jìn)行miRNA分析顯示，miR-9*(編碼miR-9的所有三種初級(jí)轉(zhuǎn)錄物之一，表達(dá)量略低于miR-9)，miR-219和miR-384-5p與SCI嚴(yán)重程度相關(guān)[27,30]。據(jù)相關(guān)學(xué)者全基因組芯片分析發(fā)現(xiàn)，通過比對(duì)阿爾茨海默癥(AD)小鼠與wt小鼠，找到了一組差異表達(dá)的lnc RNAs，如Nudt19，Arl16，Aph1b等，這些均可作為AD樣神經(jīng)退行性早期和晚期階段的潛在生物標(biāo)志物。因此，ncRNAs的變化量有助于分析患者病情并評(píng)價(jià)治療效果。

神經(jīng)再生為CNS損傷或神經(jīng)退行性疾病的治療提供了這樣一種可能性： 在不久的將來，我們可使用細(xì)胞替代療法用以修復(fù)變性損傷的神經(jīng)元。成人CNS的許多不同區(qū)域中具有產(chǎn)生新神經(jīng)元潛力的干細(xì)胞，暗示了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞可以用于替換神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元的可能性，并且誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)育的過程可以在成人CNS的某些區(qū)域重現(xiàn)，使得具備功能性的新神經(jīng)元與現(xiàn)有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相整合。不足的是，一般認(rèn)為在正常生理?xiàng)l件下成人CNS區(qū)域中的神經(jīng)再生非常有限，這提示了人為誘導(dǎo)神經(jīng)再生的重要性。

因此，基于ncRNAs具有誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)再生的特性，其作為一種治療CNS損傷或神經(jīng)退行性病變發(fā)的新思路被正式提出。

4 展 望

ncRNAs是細(xì)胞中一類不編碼蛋白質(zhì)的分子，包括miRNAs、lncRNAs等。ncRNAs和其靶基因通過表觀遺傳因子和轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行相互作用，從而影響NSCs的命運(yùn)決定，進(jìn)而對(duì)CNS發(fā)揮正常功能以及損傷后神經(jīng)再生進(jìn)行調(diào)控。神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生后，ncRNAs在病理診斷、臨床治療以及病情預(yù)后分析等方面都有重要作用[30]。目前關(guān)于ncRNAs的研究正在逐漸深入并走向臨床，例如有部分學(xué)者傾向于研究ncRNAs與表觀因子和轉(zhuǎn)錄因子的具體作用位點(diǎn)，從而更深刻地了解ncRNAs發(fā)揮調(diào)控作用的具體機(jī)制。另一方面，臨床上也在探究ncRNAs與藥物聯(lián)合治療的相互作用關(guān)系，試圖為臨床治療開辟新的途徑。而目前，包括藥物、手術(shù)治療、介入等神經(jīng)疾病的傳統(tǒng)治療手段的最終效果仍不盡人意，因此針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞療法正在逐漸興起，其中ncRNAs正扮演著重要角色。ncRNAs調(diào)控神經(jīng)元形成的根本機(jī)制正逐漸被大家熟知，但目前對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ncRNAs的研究還處于初步階段，例如近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的ncRNA，即環(huán)狀RNA(circRNA)，它可以通過與miRNA、lncRNAs等競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合相同的mRNA從而發(fā)揮其調(diào)控作用。近年發(fā)現(xiàn)miRNA自身也會(huì)發(fā)生甲基化[31]，這說明調(diào)控者本身也受到修飾。這些新發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元的形成、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中又扮演著怎樣的角色，這個(gè)問題還亟待進(jìn)一步的研究。隨著研究的繼續(xù)深入，精準(zhǔn)醫(yī)療也進(jìn)入到大數(shù)據(jù)時(shí)代。目前日益發(fā)展的全基因組水平的測(cè)序和RNA-seq，RNA CaptureSeq和ChIP-seq等生物信息學(xué)分析方法，將有助于提高我們對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認(rèn)識(shí)，為今后的臨床治療提供新的思路。綜上，深入研究神經(jīng)系統(tǒng)中ncRNAs的功能和作用機(jī)制，將加強(qiáng)我們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、功能及疾病的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也可為某些治療藥物的設(shè)計(jì)與研發(fā)提供新的思路。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的大背景下，我們有理由相信： 當(dāng)ncRNAs這一類小分子的作用位點(diǎn)，作用機(jī)制等關(guān)鍵點(diǎn)被系統(tǒng)性地認(rèn)知之后，它們將可真正的被運(yùn)用于臨床。