自噬和線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用研究進(jìn)展

王 敏，余 薇，查文良

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

21世紀(jì)以來(lái)，由于社會(huì)老齡化程度不斷加重及肥胖率的快速增加，糖尿病的患病率也與日俱增。迄今為止，全世界糖尿病的患病人數(shù)大概是4.2億，推測(cè)到2040年，糖尿病患者將達(dá)到6.42億[1]，中國(guó)是糖尿病高發(fā)國(guó)家。糖尿病可引起全身多器官、多系統(tǒng)的損害，約一半以上的糖尿病患者死于糖尿病心血管病并發(fā)癥，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的危險(xiǎn)因素占首位，可導(dǎo)致患者心力衰竭而死亡。

1 DCM與線粒體損傷

DCM是一種不同于高血壓性心臟病、冠心病及其他心臟病變的糖尿病并發(fā)癥。臨床上表現(xiàn)為心功能異常，最后演變成心力衰竭、心律失常和心源性休克，嚴(yán)重者猝死。目前，DCM的具體發(fā)病機(jī)制不明，已有研究表明，糖脂代謝異常、心臟自主神經(jīng)病變、胰島素抵抗、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)激活、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、線粒體損傷等均參與DCM的發(fā)生發(fā)展。

線粒體通過(guò)氧化磷酸化為心肌細(xì)胞提供能量，線粒體質(zhì)量控制與心功能關(guān)系密切。事實(shí)上，在很多糖尿病動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)心肌線粒體生物合成和超微結(jié)構(gòu)異常出現(xiàn)受損線粒體[2]。Anderson等[3]在2型糖尿病患者的心房中發(fā)現(xiàn)線粒體出現(xiàn)呼吸功能障礙，同時(shí)，也有研究者在經(jīng)鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)注射與高脂飲食(high fat diet，HFD)建立的糖尿病模型大鼠心肌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)紊亂、線粒體順烏頭酸酶活性降低，發(fā)生呼吸功能障礙[4]。這些表明糖尿病心肌中線粒體結(jié)構(gòu)及功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致線粒體糖脂代謝紊亂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加、線粒體分裂增加、線粒體依賴(lài)性凋亡途徑激活等，引起心肌損傷。因此，及時(shí)清除受損線粒體能減少糖尿病心肌損傷。

2 自噬及線粒體自噬

2.1自噬概述自噬是真核生物細(xì)胞經(jīng)溶酶體，清除自身受損細(xì)胞器過(guò)程的統(tǒng)稱(chēng)，是細(xì)胞自我更新、清除受損細(xì)胞器的過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞處于某些環(huán)境中，細(xì)胞器受損發(fā)生功能障礙時(shí)，自噬會(huì)清除這些細(xì)胞組分，維持細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)，保障細(xì)胞質(zhì)量控制。

2.2線粒體自噬概述線粒體作為一種存在于大部分真核生物細(xì)胞中的細(xì)胞器，能形成ATP給細(xì)胞供給能量，與此同時(shí)，它也介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。線粒體自噬(mitophagy)即細(xì)胞經(jīng)過(guò)自噬程序，并特異選擇性地降解受損的或不需要的線粒體。研究者通過(guò)酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)線粒體自噬進(jìn)行了大量研究，線粒體自噬主要的調(diào)節(jié)機(jī)制如下：

2.2.1酵母中的線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制 在酵母中，自噬相關(guān)蛋白(autophagy related gene, Atg)對(duì)自噬的發(fā)生影響極大。因此，核心Atg功能的缺陷會(huì)影響自噬的發(fā)生。2009年，Okamoto等[5]鑒定出的Atg32，被認(rèn)為是特異性地參與線粒體選擇性自噬的因子。細(xì)胞在ROS刺激下，Atg32表達(dá)明顯增加，而Atg32的缺失導(dǎo)致受損線粒體降解被抑制，表明Atg32作為酵母線粒體上一種自噬受體，介導(dǎo)了線粒體的質(zhì)量控制[5]。

2.2.2哺乳動(dòng)物線粒體自噬調(diào)控機(jī)制

2.2.2.1線粒體的分裂和融合對(duì)自噬的影響 細(xì)胞內(nèi)線粒體處于線粒體融合和分裂的平衡之中。線粒體分裂對(duì)線粒體自噬水平有極大影響，它能使線粒體變小，更易被自噬小泡包裹而降解。線粒體分裂受線粒體分裂蛋白(Fis1)和動(dòng)力相關(guān)蛋白(Drp1)的調(diào)控，它們相互作用，促進(jìn)線粒體的分裂。受損的線粒體部分會(huì)在線粒體分裂過(guò)程被“切除”出來(lái)，形成受損的和健康的兩種線粒體部分。健康線粒體在視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)和線粒體融合蛋白1/2(Mfn1/2)作用下，融合到其他健康線粒體上。而被分離出的受損線粒體由于膜電位下降，引起OPA1被蛋白酶水解，以及誘導(dǎo)Mfn1/2被Parkin泛素化經(jīng)蛋白酶體降解，減少線粒體的融合，有利于受損線粒體的分裂，使自噬形成更容易。所以，線粒體的分裂與融合對(duì)線粒體自噬有十分重要的影響。

2.2.2.2PINKl/Parkin信號(hào)通路 PINK1/Parkin通路是目前研究比較多的介導(dǎo)線粒體自噬的通路。假定激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)是一種在胞質(zhì)中合成的蛋白激酶，它從線粒體膜通道進(jìn)入線粒體后，被內(nèi)膜上相關(guān)蛋白酶水解。當(dāng)線粒體受損時(shí)，膜電位發(fā)生去極化，PINK1水解受到抑制，從而堆積在線粒體外膜上。Parkin是一種胞質(zhì)的E3連接酶，可以識(shí)別受損的線粒體。PINK1招募胞質(zhì)內(nèi)的Parkin轉(zhuǎn)至受損的線粒體膜上，因Parkin的E3活性，同時(shí)將泛素連接到位于線粒體的底物上，引起膜上蛋白泛素化。發(fā)生泛素化的線粒體則可以被接頭蛋白P62(一種由自噬作用降解的聚氨酯結(jié)合蛋白，其蛋白水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān))識(shí)別，其上帶有與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)相互作用的區(qū)域(LIR)，與LC3結(jié)合連接到自噬小泡膜上，形成線粒體自噬體，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[6]。

2.2.2.3線粒體自噬的膜受體NIX和FUNDC1 NIX也被稱(chēng)為BNIP3L，與BNIP同源，都是Bcl-2家族促凋亡蛋白成員，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程，還可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。NIX上存在LIR，NIX能通過(guò)該區(qū)直接與LC3/GABARAP作用，招募LC3至自噬體上，引起特異性線粒體自噬的發(fā)生。NIX敲除的小鼠紅細(xì)胞中線粒體清除發(fā)生障礙，提示在網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)，NIX通過(guò)參與調(diào)控線粒體自噬，清除細(xì)胞內(nèi)部受損線粒體，最終使其形成完全成熟的紅細(xì)胞，NIX/BNIP3在線粒體自噬中起到關(guān)鍵作用。

FUNDC1是存在于線粒體外膜的蛋白，與NIX、BNIP3類(lèi)似的是，F(xiàn)UNDC1能直接通過(guò)LIR序列和LC3結(jié)合來(lái)招募自噬體。若LIR序列缺失，F(xiàn)UNDC1將無(wú)法參與線粒體自噬的調(diào)控。FUNDC1與LC3結(jié)合可以介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬。有研究表明，過(guò)表達(dá)的FUNDC1使線粒體碎片增加，并伴隨線粒體自噬增加，而FUNDC1敲除會(huì)減少線粒體的分裂，抑制線粒體自噬發(fā)生[7]。因此，F(xiàn)UNDC1不僅能作為線粒體自噬的膜受體，也能通過(guò)影響線粒體分裂，增加線粒體碎片來(lái)介導(dǎo)線粒體自噬[8]。FUNDC1是能與BNIP3、OPA1相互作用，參與調(diào)節(jié)線粒體自噬的重要蛋白。

3 自噬、線粒體自噬與DCM的關(guān)系

隨著對(duì)自噬研究的展開(kāi)，線粒體自噬被指出可能是DCM發(fā)病的一種機(jī)制。然而，目前研究人員對(duì)于自噬以及線粒體自噬在DCM中的變化持有不同觀點(diǎn)。

3.1自噬在1型糖尿病中的變化由于胰島素激活了PI3K/Akt/mTORC1通路，最初認(rèn)為自噬在1型糖尿病(type 1 diabetes, T1D)和2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)中都會(huì)增加。然而，很多研究表明，自噬在T1D動(dòng)物的心臟中實(shí)際上被抑制了[9-10]，并且T1D小鼠模型中，心臟自噬水平減弱很有可能因?yàn)椴溉閯?dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTORC1)活性增加，或AMP激活的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)活性減少產(chǎn)生的[11-12]。Xie等[11]研究表明，OVE26小鼠和STZ誘導(dǎo)的T1D小鼠心臟自噬程度降低，并且能通過(guò)二甲雙胍恢復(fù)AMPK活性，增強(qiáng)自噬。He等[13]發(fā)現(xiàn)，在T1D動(dòng)物模型中，高糖血癥通過(guò)增加Bcl-2與Beclin-1之間的相互作用，抑制H9c2心肌細(xì)胞的自噬，使小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，而二甲雙胍治療能減少Bcl-2與Beclin-1結(jié)合，具有上調(diào)自噬和釋放Bcl-2來(lái)抑制凋亡的雙重作用。二甲雙胍通過(guò)恢復(fù)AMPK活性，增強(qiáng)自噬能力，改善心功能。這些結(jié)果表明，自噬減少導(dǎo)致心臟損傷是因?yàn)閷?duì)功能失調(diào)的細(xì)胞器及蛋白聚集物的清除發(fā)生了障礙，而自噬增強(qiáng)可以減少T1D小鼠心臟損傷。同樣，Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，STZ小鼠心肌中自噬流減少，表明心肌自噬被抑制，但對(duì)于T1D中自噬對(duì)糖尿病心肌的影響，Xu有不同觀點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白Atg16和Beclin-1缺陷型的STZ、OVE26小鼠心臟損傷有所減少，這些小鼠的心臟功能明顯提升，氧化應(yīng)激水平、間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡情況都減弱了。相反，心臟特異性的Beclin-1轉(zhuǎn)基因小鼠增強(qiáng)了自噬活性，導(dǎo)致糖尿病引起的心臟凋亡和纖維化。他們認(rèn)為，自噬水平降低能夠抑制T1D模型小鼠的心臟損傷，因此，糖尿病心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平減弱，被看成是一種能夠防止細(xì)胞被自噬過(guò)度降解的適應(yīng)性反應(yīng)，避免心肌細(xì)胞減少，心功能進(jìn)一步受損。由于外界環(huán)境導(dǎo)致線粒體受損產(chǎn)生大量ROS，此時(shí)細(xì)胞通過(guò)增加自噬水平來(lái)清除受損線粒體，防止心肌損傷。適量的增加自噬水平，可以看作是細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)保護(hù)心肌受損。但同時(shí)，過(guò)度的自噬也會(huì)導(dǎo)致正常線粒體受損，使細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，最終導(dǎo)致心肌損傷。因此，機(jī)體中自噬發(fā)生的“量”是影響DCM的關(guān)鍵因素。適當(dāng)清除受損線粒體才對(duì)糖尿病心肌有最佳的保護(hù)作用。

3.2自噬在T2D中的變化目前就T2D與心肌自噬關(guān)系的研究結(jié)論還不是非常確定，有研究發(fā)現(xiàn)，在HFD誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠心肌中，自噬被抑制[14]；在果糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗和高糖血癥心肌中，自噬被激活[15]；也有的研究發(fā)現(xiàn)，自噬情況保持不變[16]。Sciarretta等[17]發(fā)現(xiàn)，HFD激活了小鼠心臟中的RAS蛋白腦組織同源類(lèi)似物(recombinant human Ras homolog enriched in brain, RHEB)，導(dǎo)致mTORC1激活，抑制自噬。他們發(fā)現(xiàn)在HFD小鼠心肌中，LC3II水平降低，P62升高。用溶酶體融合抑制劑氯喹處理后，HFD小鼠心臟中GFP-LC3的熒光陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有增加，表明其未能形成自噬體。相對(duì)的，當(dāng)Xu等[18]在胰島素抵抗和代謝綜合征的背景下觀察自噬流時(shí)，發(fā)現(xiàn)HFD小鼠心臟功能受損，并將LC3II堆積在心臟中，提示自噬體的數(shù)量增加了。他們還指出，P62的積累表明自噬體降解受阻。通過(guò)透射電子顯微鏡，在HFD小鼠的心臟中觀察到自噬體的累積，自噬溶酶體缺乏。此外，HFD小鼠用氯喹處理后，沒(méi)有積累額外的LC3II，而控制飲食的小鼠卻有此現(xiàn)象，證明HFD導(dǎo)致小鼠心臟組織中自噬體清除發(fā)生障礙。因此，Sciarretta等[17]認(rèn)為，在HFD小鼠的心臟中，自噬體的形成被抑制，Xu等[18]指出自噬體降解受阻。綜上所述,這些研究表明T2D小鼠心臟自噬流受損。但最近Munasinghe等[19]發(fā)現(xiàn)，T2D通過(guò)Beclin-1通路，增加患者心肌內(nèi)自噬。他們通過(guò)冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)收集糖尿病患者與非糖尿病患者的左心耳，并進(jìn)行免疫熒光與Western blot分析，觀察到LC3B-II和Beclin-1表達(dá)增加，而P62表達(dá)減少。電鏡觀察到糖尿病心肌中自噬體增加，同時(shí)，他們給患者注射氯喹后，在體內(nèi)檢測(cè)自噬流，發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌中LC3B-II水平增加，證明T2D心肌中自噬活性增加。而高糖培養(yǎng)的Beclin-1缺陷型小鼠心肌內(nèi)，自噬水平被抑制，說(shuō)明糖尿病通過(guò)Beclin-1通路來(lái)增加自噬水平。自噬研究中，LC3B及P62的表達(dá)水平常被用作檢驗(yàn)自噬情況的標(biāo)準(zhǔn)。然而，自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，僅僅評(píng)價(jià)LC3II的表達(dá)或自噬體數(shù)量不能代表整個(gè)自噬過(guò)程，只有基于自噬流的研究結(jié)果才更為可靠，未來(lái)還需要更多研究闡明。

HFD糖尿病小鼠的心肌內(nèi)，自噬增強(qiáng)似乎是一種保護(hù)性的反應(yīng)，可以減少心臟損傷。例如，在HFD小鼠心臟中持續(xù)激活RHEB和mTORC1，會(huì)導(dǎo)致自噬抑制，加劇了心肌梗死后缺血性損傷，而HFD小鼠心肌在mTOR缺陷和雷帕霉素(mTORC1的強(qiáng)效抑制劑，也是自噬的誘導(dǎo)劑)處理恢復(fù)自噬后，HFD心肌損傷減少[17]，提示T2D中自噬減少導(dǎo)致心臟損傷。由PRAS40(蛋白激酶B的作用底物，亦是mTORC1的特異性結(jié)合蛋白)介導(dǎo)引起mTORC抑制，能降低HFD誘導(dǎo)的DCM的發(fā)生率，雷帕霉素處理后，db/db2型糖尿病小鼠的心臟功能加強(qiáng)[20]。這些研究證明，在T2D小鼠心肌中，自噬水平增加能減少心臟損傷。

3.3糖尿病心肌中自噬與線粒體自噬自噬活性不能表示非標(biāo)準(zhǔn)自噬的狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠注射STZ后的3周，自噬水平減少，而線粒體自噬到后期才減少，并且Beclin-1或Atg16缺陷型糖尿病小鼠心肌恢復(fù)了PINK1、Parkin和溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein1, LAMP1)的表達(dá)和線粒體定位，Rab9(一種與非標(biāo)準(zhǔn)自噬有關(guān)的小GTP結(jié)合蛋白，當(dāng)缺乏Atg5時(shí)，在紅細(xì)胞成熟過(guò)程中負(fù)責(zé)線粒體降解)線粒體表達(dá)也增加，并且在線粒體中Rab9蛋白含量增加更為明顯[12]，說(shuō)明Rab9可能被轉(zhuǎn)移到線粒體中，介導(dǎo)線粒體在糖尿病心臟中的降解。這些結(jié)果表明，恢復(fù)的線粒體自噬可能減輕自噬缺陷糖尿病小鼠心肌損傷，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)自噬被抑制，選擇性自噬上調(diào)，在糖尿病早期這可能會(huì)促使線粒體自噬增加，保護(hù)糖尿病心臟。

線粒體自噬能維持心肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在心臟中起重要作用。目前，對(duì)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬研究較多，多項(xiàng)研究已經(jīng)證明，PINK1和Parkin蛋白水平在糖尿病動(dòng)物組織，包括心臟中都是減少的[21]。Scheele等[22]發(fā)現(xiàn)，PINK1在T2D病人骨骼肌中被抑制。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在T1D心肌中自噬水平減少，PINK1和Parkin水平也明顯減少，高血糖抑制線粒體自噬，導(dǎo)致受損線粒體堆積，使細(xì)胞凋亡[23]。在Parkin缺陷的心臟中，線粒體自噬被抑制，導(dǎo)致受損線粒體堆積，細(xì)胞死亡，說(shuō)明PINK/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬障礙會(huì)導(dǎo)致心臟損傷[24]。高蓓蕾等[25]發(fā)現(xiàn)，高糖會(huì)抑制SD大鼠原代心肌細(xì)胞自噬水平，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，而Drp1、Parkin蛋白通過(guò)增加線粒體自噬水平，改善線粒體功能，減少心肌細(xì)胞凋亡。以上表明糖尿病心肌中線粒體自噬減少使心肌受損，而線粒體自噬增加能抑制糖尿病心肌損傷，其中的作用機(jī)制尚不清楚。可以猜測(cè)在糖尿病心肌中，前期自噬水平降低引起線粒體自噬上調(diào)，對(duì)心肌起到保護(hù)作用，到DCM后期，線粒體清除能力下降，造成受損線粒體堆積，導(dǎo)致心肌受損。

4 小結(jié)

在T1D和T2D中，自噬情況有很大差異。T1D小鼠模型中，心臟自噬水平被抑制很可能是由于mTORC1活性增加或AMPK活性減少產(chǎn)生的，大量受損線粒體無(wú)法被清除而累積在心肌，最終導(dǎo)致心功能障礙。而在T2D中，自噬水平的變化是非定性的，說(shuō)明T2D中，線粒體的自噬水平是非常復(fù)雜的。自噬的狀態(tài)也不完全反映線粒體自噬的狀態(tài)。作為一種選擇性自噬，線粒體自噬在心臟中有重要作用，目前少量研究表明，糖尿病心肌中PINK1/Parkin、Drp1介導(dǎo)的線粒體自噬減少，導(dǎo)致心肌損傷，這能為DCM防治提供新思路，但還需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)該研究領(lǐng)域作進(jìn)一步的闡述，這會(huì)成為未來(lái)幾年對(duì)DCM的研究熱點(diǎn)，也許還會(huì)成為治療DCM的新入手點(diǎn)。