水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白工藝優(yōu)化

,

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

蜂王漿(royaljelly,RJ),是蜂王整個(gè)生命當(dāng)中唯一的食物,是決定蜜蜂幼蟲成為工蜂還是蜂王的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)表明它具有延緩衰老、增加機(jī)體免疫力、增強(qiáng)記憶力、防癌抗癌等保健功能和療效,這些功能和療效大多跟蜂王漿中所含的豐富的蛋白質(zhì)密切相關(guān)[1-2]。蜂王漿蛋白質(zhì)約占其干物質(zhì)的50%,可分為水溶性蛋白質(zhì)和水不溶性蛋白質(zhì),其中水溶性蛋白質(zhì)約占蜂王漿總蛋白的46%～89%,是蜂王漿中最主要的活性成分,是代表蜂王漿新鮮度和質(zhì)量的重要標(biāo)志[3-4]。但是由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上銷售的僅有鮮蜂王漿或其凍干粉產(chǎn)品,研發(fā)蜂王漿水溶性蛋白相關(guān)的新產(chǎn)品十分必要[5]。因此,對(duì)于蜂王漿水溶性蛋白的研究具有非常重要的意義。

目前對(duì)蜂王漿水溶性蛋白的提取多采用堿溶酸沉、鹽提酸沉法等,與這些方法相比,水提銨沉法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、可保存被分離物生物活性等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。因此,本實(shí)驗(yàn)以水溶性蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)、PB實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化分析,對(duì)蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂王漿 黑龍江密山蜂場(chǎng),-20 ℃凍藏;牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司;硫酸銨、硫酸鉀、95%乙醇、鹽酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、85%磷酸等 均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-6300型紫外可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;KND-04微量凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司;KQ3200B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝 將10.0 g蜂王漿與蒸餾水按一定比例混合,攪拌使其充分混勻,超聲波(150 W)提取一段時(shí)間后于4 ℃離心,去沉淀,收集上清液,加入硫酸銨,調(diào)節(jié)pH,沉淀一段時(shí)間,4 ℃、12000 r/min離心20 min,去上清液,收集沉淀得到含鹽蛋白質(zhì),透析除鹽,得蛋白提取液。

1.2.2 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.1的工藝提取蜂王漿水溶性蛋白,固定超聲波提取30 min,硫酸銨飽和度70%,調(diào)pH到6,沉淀40 min,考察不同料水質(zhì)量比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質(zhì)量比1∶20,硫酸銨飽和度70%,調(diào)pH到6,沉淀40 min,考察不同超聲波提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取40 min,調(diào)pH到6,沉淀40 min,考察不同硫酸銨飽和度(60%、70%、80%、90%、100%)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取40 min,硫酸銨飽和度90%,沉淀40 min,考察不同pH(5、6、7、8、9)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取40 min,硫酸銨飽和度90%,pH5,考察不同沉淀時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 PB實(shí)驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實(shí)驗(yàn),對(duì)上述5個(gè)因素加以考察,每個(gè)因素選擇-1和1兩個(gè)水平,將蜂王漿水溶性蛋白提取率作為響應(yīng)值[9]。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼如表1所示。

表1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in Plackett-Burman design

1.2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 固定超聲波提取時(shí)間40 min,沉淀時(shí)間50 min,以PB實(shí)驗(yàn)選定因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and level design of response surface methodology

1.2.3 水溶性蛋白提取率測(cè)定 參考GB5009.5-2016中方法測(cè)定蜂王漿總蛋白含量。參考《進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全實(shí)驗(yàn)方法》中第20部分Bradford法測(cè)定提取所得蜂王漿水溶性蛋白含量,得到線性回歸方程:y=0.0062x+0.0621,R2=0.9999,表明牛血清蛋白含量(x)與吸光度(y)之間有非常明顯的線性關(guān)系,將樣品吸光度代入該方程,即可得樣品蜂王漿中所含水溶性蛋白含量,再根據(jù)公式(1)計(jì)算出蜂王漿水溶性蛋白的提取率。

蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=提取液中水溶性蛋白質(zhì)量/蜂王漿總蛋白含量×100

式(1)

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 PB實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面的設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析利用Design-expert8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料水質(zhì)量比對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖1所示,水溶性蛋白提取率隨著料水質(zhì)量比的增大出現(xiàn)先增高后略微降低的趨勢(shì),并且料水質(zhì)量比在1∶20時(shí)最高。這可能是因?yàn)榱纤|(zhì)量比太低的情況下水溶性蛋白不能完全溶于水中,隨著料水質(zhì)量比的增大,水溶性蛋白逐漸最大限度的溶于水中,而過高的料水質(zhì)量比會(huì)使得體系中的蛋白質(zhì)太過分散,有效組分含量減少,難以全部回收,導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[10],因此,料水質(zhì)量比選取1∶20。

圖1 料水質(zhì)量比對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of the mass ratio of material and water on extraction rate of water-soluble protein

2.1.2 超聲波提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖2所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著超聲波提取時(shí)間的增加,出現(xiàn)先升高后略微降低的趨勢(shì),并且在超聲波提取時(shí)間40 min時(shí)最高。超聲波通過波源的振蕩作用,使提取物的外表受到機(jī)械損傷和破碎,使溶脹的時(shí)間大大地減少。超聲空化作用使得蛋白質(zhì)在較短時(shí)間內(nèi)最大限度的溶出,而超聲空化作用時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得蛋白質(zhì)變性,從而導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[11-12]。因此,超聲波提取時(shí)間選擇40 min。

圖2 超聲波提取時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of water-soluble protein

2.1.3 硫酸銨飽和度對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖3所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著硫酸銨飽和度的增加,出現(xiàn)逐漸升高并趨于恒定的趨勢(shì),并且在硫酸銨飽和度100%時(shí)最高。硫酸銨飽和度越大,水溶性蛋白沉降越多,90%以后趨于最大限度沉降。所以考慮到節(jié)約資源,硫酸銨飽和度選擇90%。

圖3 硫酸銨飽和度對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate saturation on extraction rate of water-soluble protein

2.1.4 pH對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖4所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著pH的增大,出現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，pH9時(shí)最高。但是堿性過強(qiáng)會(huì)使得蛋白質(zhì)發(fā)生脫氨、脫羧等情況[13-16],有較大氨味。因此,pH選擇5。

圖4 pH對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of water-soluble protein

2.1.5 沉淀時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響 如圖5所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著沉淀時(shí)間的增加,出現(xiàn)先增高后趨于恒定的趨勢(shì),并且在沉淀時(shí)間60 min時(shí)最高。沉淀時(shí)間越長(zhǎng)沉降越多,50～60 min逐漸趨于最大沉降限度。所以考慮節(jié)約資源問題,沉淀時(shí)間選擇50 min。

圖5 沉淀時(shí)間對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of precipitation time on extraction rate of water-soluble protein

2.2 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實(shí)驗(yàn),對(duì)上述5個(gè)因素加以考察,結(jié)果如表3所示。

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of PB experiment

2.2.2 PB實(shí)驗(yàn)方差分析 利用Design-expert 8.0軟件進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程為:蜂王漿水溶性蛋白提取率Y=71.05-1.81A+0.45B+1.86C+2.57D+1.23E,且回歸模型(p<0.05)顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差分析如表4所示,5個(gè)因素影響大小順序?yàn)镈>C>A>E>B,其中料水質(zhì)量比、硫酸銨飽和度、pH對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著,因此選定該三個(gè)因素進(jìn)行接下來的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

表4 PB實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 The variance analysis of PB experiment

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance(ANOVA)of the regression model

注：***為極顯著(p<0.001),**為非常顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以單因素及PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇料水質(zhì)量比、硫酸銨飽和度、pH三個(gè)因素,利用響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白實(shí)驗(yàn)方案。結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of the response surface methodology

2.3.2 回歸模型的方差分析 運(yùn)用響應(yīng)面軟件將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率與料水質(zhì)量比、硫酸銨飽和度及pH三因素間的回歸方程:水溶性蛋白提取率Y=80.75+1.20A+1.08B-0.93C-0.20AB-1.60AC-0.83BC-6.28A2-3.73B2-2.84C2。該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,初步推斷響應(yīng)面開口向下,在各因素所選水平范圍內(nèi)具有極大值點(diǎn),能夠進(jìn)行蜂王漿水溶性蛋白提取率工藝的優(yōu)化分析[17-18]。

回歸模型的方差分析結(jié)果如表6所示,回歸模型R2=0.9953,即擬合優(yōu)度為99.53%,表示該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高,自變量和響應(yīng)值間有明顯的線性關(guān)系,所以該模型可對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取工藝進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。該模型p<0.001(極顯著),失擬項(xiàng)=0.7805>0.05(不顯著),表明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)很吻合,實(shí)驗(yàn)誤差較小,模型選擇正確。料水質(zhì)量比、硫酸銨飽和度和pH的p值均小于0.001,說明三因素對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響均極顯著。F值大小能夠反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[10-13],可得出三者對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響程度依次是:pH>料水質(zhì)量比>硫酸銨飽和度。交互項(xiàng)AB影響不顯著(p>0.05),交互項(xiàng)AC影響極顯著(p<0.001),交互項(xiàng)BC影響非常顯著。

2.3.3 響應(yīng)面分析圖 從圖6能夠清楚的觀察到各因素及其交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響。從圖6a中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和pH的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面均不陡峭,表明二者對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響不顯著。從圖6b中可以看出,隨著pH和硫酸銨飽和度的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面弧度較大且pH面較陡峭,表明pH對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響較硫酸銨飽和度更大,這與方差分析結(jié)果一致。從圖6c中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和硫酸銨飽和度的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面圖形曲面弧度較大且料水質(zhì)量比面較陡峭,表明料水質(zhì)量比對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響較硫酸銨飽和度更大。

圖6 交互作用對(duì)蜂王漿水溶性蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface plots for effects of interaction on the extraction rate of water-soluble protein

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述回歸模型,通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件是:料水質(zhì)量比1∶20 g/mL、硫酸銨飽和度88.94%、pH5.08,并得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的預(yù)測(cè)值是80.63%。為檢驗(yàn)該結(jié)果的可靠性,擬采用上述響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得水提銨沉法提取的條件,并結(jié)合實(shí)際情況,在料水質(zhì)量比1∶20、硫酸銨飽和度89%、pH5的條件下,經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為80.22%,與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得預(yù)測(cè)值接近,響應(yīng)面優(yōu)化分析回歸模型可信度較高,所得最佳條件具有可行性[19]。

3 結(jié)論

采用水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白,并在單因素實(shí)驗(yàn)和PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化分析并結(jié)合實(shí)際情況,確定水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件:料水質(zhì)量比為1∶20、超聲波提取時(shí)間為40 min、硫酸銨飽和度為89%、pH為5、沉淀時(shí)間為50 min。通過該最佳提取條件得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為80.22%,與理論預(yù)測(cè)值的誤差小于0.5%,表明所建蜂王漿水溶性蛋白提取回歸模型成功。

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